哈维氏弧菌溶血素的包涵体纯化、多抗制备及活性验证

为进一步研究哈维氏弧菌溶血素(Vibrio harveyi hemolysin, VHH)的生物学功能,构建了vhh原核表达载体,并利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用DOT-ELISA和Western-blot方法检测抗体的效价及特异性,并通过溶血试验评估抗体对哈维氏弧菌培养物上清溶血活性的影响。结果表明:在构建得到的表达菌株pET28a-vhh-BL21(DE3)中,重组蛋白以包涵体形式大量表达;对该重组蛋白进行纯化并复性后,利用纯化的蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为1∶163 840,可特异性识别VHH蛋白,且稀释倍数小于1000时,可显著抑制哈维氏弧菌培养物上清的溶血活性。本研究结果对VHH单抗的制备、哈维氏弧菌检测手段的完善及哈维氏弧菌的疫苗研发具有一定参考作用。     

猪圆环病毒2型荧光抗体的原核表达及初步应用

本研究旨在利用原核大肠杆菌系统表达1株猪圆环2型病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)小分子荧光抗体,以及该荧光抗体用于PCV2病毒直接免疫荧光(Direct immunofluorescence assay,DIF)检测。选取1株筛选到的PCV2特异性纳米抗体基因V22,按照E.coli原核表达系统进行密码子优化重新合成,与荧光蛋白基因融合后插入p ET28(a)中,20℃条件下诱导表达16 h,利用SDS-PAGE、Western-blot技术鉴定蛋白是否表达及其可溶性,并对可溶荧光抗体蛋白进行镍柱亲和层析纯化,纯化蛋白用于建立PCV2特异性DIF检测方法,同时对其工作条件、工作浓度、特异性以及稳定性进行验证,并与PCV2经典间接免疫荧光检测方法进行比较,验证其灵敏度。结果表明,PCV2荧光抗体基因在E.coli原核表达系统中表达,可溶蛋白占目的蛋白的60%左右;纯化后荧光抗体蛋白呈现明显绿色,具有良好的荧光活性,不同批次表达及纯化的荧光抗体效果一致,-20℃保存6个月后抗体效价不变;PCV2特异性DIF试验结果表明该荧光抗体只对PCV2病毒感染细胞具有良好的反应原性,利用该抗体建立的直接免疫荧光法能够用于PCV2病毒滴度的测定,滴度测定结果与间接免疫荧光法检测结果一致。说明,在原核系统中成功表达PCV2的小分子荧光抗体,该荧光抗体蛋白具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,用该抗体建立的PCV2特异性DIF操作简单,且具有较好的特异性和敏感性,对PCV2的检测有潜在应用价值。     

重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制

【目的】制备金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)基因工程亚单位疫苗,并以小白鼠为试验模型,检测其免疫保护效果。【方法】诱导表达FnbpA,经组氨酸标签亲合纯化后用Bradford法测定纯化的目的蛋白的含量,并检测其黏附活性及对动物的安全性。制备FnbpA亚单位疫苗,经无菌检验及安全检验后,进行免疫保护试验,用ELISA方法检测被免疫小鼠血清中的抗体效价,通过腹腔攻毒试验检测疫苗的免疫保护力。【结果】纯化的目的蛋白在80 ku处出现单一条带,蛋白质量浓度为0.245 mg/mL。细菌黏附抑制试验发现,经FnbpA蛋白预处理过的MDBK细胞黏附的金黄色葡萄球菌数较对照极显著减少;动物安全性试验显示,小鼠注射FnbpA亚单位疫苗后均健活,表明制备的FnbpA亚单位疫苗安全性良好。所有免疫组小鼠于首免后7 d即可在血清中检测到特异性抗体,抗体效价逐渐上升,在21 d达到最高值,之后逐渐降低。【结论】纯化的FnbpA蛋白达到了电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性;制备的FnbpA亚单位疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律,且表现出良好的免疫保护力。     

抗人轮状病毒IgY的制备

利用能引起婴儿腹泻的轮状病毒制备灭活疫苗,免疫产蛋母鸡,并用ELISA法检测抗体活性。结果表明:母鸡在免疫后第11 d卵黄中出现特异性抗体,加强免疫后抗体活性迅速升高,免疫35~42 d达到高水平,3次免疫后活性较长时间不下降。经硫酸铵两步沉淀法从鸡卵黄中分离抗人轮状病毒卵黄免疫球蛋白(抗HRV-IgY),透析纯化IgY测得抗体蛋白含量达14 mg/m l蛋黄液。     

新疆双峰驼抗血清中重链抗体的分离鉴定

【目的】初步探讨新疆双峰驼Camelus bactrianus免疫系统中缺失轻链的重链抗体(heavy chain antibody,HCAb)是否具有常规抗体的基本抗原结合功能。【方法】采用本实验室构建的丹毒丝菌表面蛋白A原核表达载体pGEX4T-1-spaA-N,进行诱导表达,纯化获得重组抗原GST-SpaA-N,免疫双峰驼制备抗血清,经Protein A和Protein G亲和层析从抗血清中分离重链抗体及常规抗体,Western blotting鉴定重链抗体的抗原结合特性,间接ELISA比较重链抗体与传统抗体的抗原结合活性。【结果】经过Protein A/G纯化得到了IgG2。对各组分进行分析初步表明重链抗体约占血清IgG的60%—80%。采用GST-SpaA-N免疫双峰驼可以诱导高滴度的IgG2型重链抗体,在5次免疫后,骆驼抗spaA-N特异的重链抗体IgG2多抗血清的效价为1﹕51200。Western blotting结果显示分离的多克隆重链抗体可特异结合SpaA天然抗原,且ELISA分析结果表明重链抗体与常规抗体具有相同的抗原结合活性。【结论】首次从双峰驼抗血清中成功分离获得具有与常规抗体相同生物学功能的多克隆重链抗体,提示重链抗体可能在骆驼免疫防御中发挥重要作用。     

猪整合素αv多克隆抗体制备与应用

利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达,纯化目的蛋白免疫小鼠,制备猪整合素αv多克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后,截取胞外区抗原性较好的基因片段,针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上,诱导表达并纯化重组蛋白,对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价,利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400,且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体,为后续相关研究提供基础。     

蜘蛛毒素医学相关生物学活性的研究进展

蜘蛛种类繁多且多数蜘蛛能够分泌毒液.蜘蛛毒液中含有丰富的蛋白质多肽并具有复杂的生物学活性.近年来,由蜘蛛毒液分离纯化出的蛋白质多肽成分日益增多,且这些生物学活性成分具有极好的药物开发价值及应用前景.该文对蜘蛛毒素的生物学活性及其机制进行了综述.     

具有抑菌和杀虫活性的中草药资源及在农药上的应用（英文）

中草药源农药是指从中草药中提取的用于防治农作物病虫害的有效成分或从中分离纯化的单体物质,它在无公害农产品生产和开发利用我国丰富的植物资源用于有害生物的防治方面具有深远意义。概述了中草药源农药对环境友好、作用方式多样、对高等动物及害虫天敌安全,且有害生物较难产生抗药性等特点;综述了49科具有抑菌和杀虫活性的中草药资源及其作用,评述了我国已开发应用的19种中草药源农药和7种规模化生产的中草药源农药产品。最后,提出了中草药农药开发应用中值得进一步研究的问题：中草药的品种选育、栽培技术和活性成分提取方法研究;中草药源有效成分的结构鉴定,植物品种与活性成分关系的基础研究;以中草药源活性成分为基础的先导化合物的研发。     

猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,在大肠杆菌中表达E2蛋白,并对其进行纯化及免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性E2蛋白。对IPTG浓度及诱导温度和时间进行优化,结果显示,IPTG终浓度为0.1 mmol/L时,18℃条件下诱导表达16 h,E2蛋白的可溶性表达量最高。通过分子筛一步纯化E2蛋白,其终质量浓度为0.5 g/L。Western blot分析和间接ELISA结果显示,纯化后的E2蛋白在变性及非变性条件下都能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2蛋白活性良好。将纯化后的E2蛋白添加弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,采集血清进行病毒中和试验,结果显示,免疫后56 d产生较高水平的中和抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。综上,成功利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了可溶性E2蛋白,且纯化后的E2蛋白免疫原性良好。     

紫蛇尾皂苷的初步纯化和生物学活性研究

对紫蛇尾Ophiopholis mirabilis皂苷粗提物进行初步纯化,并对所得产物的抑菌活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性和细胞毒活性进行了研究。采用AB-8大孔吸附树脂初步纯化紫蛇尾皂苷粗提物,采用香草醛—高氯酸法测定总皂苷含量,采用滤纸片法测定抑菌活性,采用比色法和MTT法分别测定α-葡萄糖苷酶和MCF-7人乳腺癌细胞的抑制率。结果表明:纯化后的紫蛇尾皂苷纯度增加至48.57%;皂苷粗提物及纯化物的抑菌活性表现一致,均对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis具有明显的抑制作用,且纯化物的抑菌效果略强;皂苷粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果明显,大孔树脂95%乙醇洗脱所得纯化物的抑制率达到94.62%;皂苷粗提物及纯化物对MCF-7人乳腺癌细胞均表现出了很强的细胞毒活性,其中大孔树脂60%、75%、95%乙醇洗脱所得纯化物的浓度为300μg/m L时,细胞抑制率均高达97%以上。研究表明,紫蛇尾皂苷粗提物及纯化物均表现出了很强的选择性抑菌活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和对MCF-7人乳腺癌细胞的细胞毒活性,且纯化物的活性增强。     

抗小鼠H-Y抗原IgY抗体的纯化

用Ni—NTA柱纯化SMCY重组蛋白,将该蛋白作为配基偶联至CNBr活化的Sepharose 4B制成亲和层析柱,分离纯化抗H—Y抗原的特异性IgY抗体。结果表明：Ni—NTA柱纯化后,SMCY重组蛋白纯度可达到80％左右;亲和层析柱纯化可以使IgY抗体的纯度达到97％,经免疫组化检测,该抗体能够结合与雄性小鼠肝脏细胞表面,而不与雌性小鼠肝脏细胞发生结合。证实了经过纯化得到的高纯度IgY抗体具有很好的抗H—Y抗原特异性。通过该方法可纯化分离得到高纯度抗H—Y抗原IgY抗体。     

新疆双峰驼纳米抗体、重链抗体和常规抗体的热稳定性比较

【目的】 比较纳米抗体、HCAbs与常规抗体之间在温度稳定性方面的差异,为研究HCAb的功能特性和骆驼适应极端环境的免疫特点提供参考。【方法】 从溶菌酶、蒜氨酸酶和丹毒丝菌表面抗原A 3种抗原免疫的新疆双峰驼血清中,采用Protein A和Protein G亲和色谱纯化IgG1、IgG2和IgG3 3种亚型抗体,并在大肠杆菌BL21(DE3)菌中表达和纯化3种纳米抗体。采用ELISA方法,测定经过22~90℃一系列热处理后、平衡至室温的各抗体与相应抗原的结合活性,以剩余抗原结合活性的百分比作为衡量抗体温度稳定性的参数。【结果】 3种抗原免疫后均能在骆驼激发明显的抗体反应。采用Protein A/G亲和色谱,从血清中纯化获得分子量分别为50 KD+25 KD、 46 KD和43 KD的IgG1、IgG2和IgG3亚型抗体。骆驼IgG2和IgG3重链抗体比IgG1具有更高的温度稳定性,其中IgG3表现出比IgG2对温度更高耐受的趋势。从细菌表达纯化的3种纳米抗体都表现出比重链抗体和常规抗体更高的温度稳定性。【结论】 抗体结构形式和分子大小可能显著影响了双峰驼抗体对温度的耐受性。     

塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64 000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。     

农药广谱特异性抗体制备技术研究进展

基于抗原-抗体特异性结合反应的农药免疫学检测技术的发展已经日趋成熟,能够帮助实现农药多残留免疫检测的广谱特异性抗体制备技术成为研究热点之一.本文介绍了农药广谱特异性抗体的原理及其常用的3种制备途径,包括选择共性结构半抗原制备抗体,独特型抗体和重组抗体.并对有机磷、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯三大类农药的广谱特异性抗体制备及免疫多残留分析技术的研究现状作一综述.     

绵羊肌内脂肪前体细胞的体外培养及分选

为建立绵羊肌内脂肪前体细胞的体外培养模型,选用组织块法培养绵羊肌内脂肪前体细胞,制备用荧光染料PE(Phycoerythrin)标记的兔抗绵羊Pref-1蛋白的多克隆抗体,通过流式细胞术分离纯化脂肪前体细胞,对纯化后的细胞进行诱导分化以及油红O染色鉴定。结果表明:利用流式细胞仪能分选纯化出被标记的肌内脂肪前体细胞且分选率近30%;纯化后得到的细胞是功能活跃的脂肪前体细胞。研究表明,用绵羊羔羊肌肉组织采用组织块培养法可以建立绵羊肌内脂肪前体细胞培养模型,抗绵羊Pref-1蛋白多克隆抗体可以作为纯化脂肪前体细胞的工具。     

膜技术分离纯化茶多糖的工艺研究

茶多糖是一类具有生物活性且结构复杂的糖蛋白复合物。结合膜集成联用技术通过微滤和超滤分离方法对粗制茶多糖溶液进行纯化,同时对纯化后的茶多糖进行结构和活性分析。结果表明,以0.05μm的膜孔径,0.2MPa的操作压力和1%的料液为最佳微滤工艺条件,再经30 k D的超滤膜进行二次纯化,多糖含量从50%提高至81%,工艺简单易行,适宜于工业化生产,同时保存多糖的活性。     

杂交竹梢枯病菌毒素蛋白的质膜结合位点

为探明杂交竹梢枯病菌毒素蛋白的质膜结合位点及在不同品种的结合活性,在低压层析分离纯化毒素蛋白的基础上,以该蛋白免疫新西兰大白兔制备毒素特异性抗血清,并将该蛋白用不同浓度的抗体吸附后处理杂交竹幼嫩枝条。结果表明:毒素所引起的症状有不同程度的减轻,说明所制备的抗体在与毒素发生特异性免疫学反应的同时,可部分封闭毒素分子上与毒素受体结合的位点;利用竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)测定杂交竹嫩枝的质膜制剂与毒素蛋白的结合活性显示,质膜制剂与毒素结合后能部分阻断毒素与其抗体的免疫学反应,即质膜制剂中含有毒素的结合位点,且不同品种的结合活性有差异;用胰蛋白酶或加热处理质膜制剂后,质膜制剂对毒素与其抗体反应的抑制作用消失,证实质膜制剂中与毒素结合的是蛋白类物质。     

海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾鮰的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾鮰IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3 μg/g的抗原免疫斑点叉尾鮰,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾鮰产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾鮰后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为 47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。     

HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析

【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结构,并将其插入pET28a载体,构建原核表达载体pETb12-scFv。将pETb12-scFv转入大肠杆菌BL21StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析;用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行分离纯化,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测纯化蛋白与HIV-1gp120的结合活性。【结果】得到了b12的单链抗体基因b12-scFv,长度为768bp;SDS-PAGE电泳结果显示,b12-scFv表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,但也有部分形成不溶的包涵体;纯化后蛋白的产量约为2mg/L;活性检测结果表明,b12-scFv对分泌表达和锚定在细胞膜表面的HIV-1gp120都具有良好的特异性结合活性。【结论】单链抗体b12-scFv可以用于HIV-1受体结合位点的表位检测。     

海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾(鱼回)的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾(鱼回)IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾(鱼回)IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾(鱼回),以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾(鱼回)产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒.结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾(鱼回)IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾(鱼回)后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为47.5％、45％和47.5％,平均相对保护率分别为40.63％、43.75％和40.63％,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌.以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一.