间接免疫荧光法在鱼类细菌性病原检测上的初步应用

免疫荧光法(Immunofluorescence technic)或称荧光抗体法(Fluorescent antibody technic)系对抗体(或抗原)标记荧光色素与相应抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈荧光现象的一种特异性免疫荧光反应方法。它较其他生物学染色方法有更高的特异性与敏感性。而间接免疫荧光法具有只需标记一种抗球蛋白抗体，可用于多种抗原抗体系统的优点。如今已被广泛应用于医学，生物学等领域。     

免疫荧光技术

本刊讯：免疫荧光技术是利用某些荧光紊通过化学方法与特异性抗体结合制成荧光抗体，荧光抗体与被检抗原特异性结合后．形成的免疫复合物在一定的波长光的激发下可产生荧光，借助荧光显微镜可检测或定位被检抗原。免疫荧光技术将免疫化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微术的高度精确性相结合。在水产养殖病原的检测上已得到一定应用。[第一段]     

应用间接荧光抗体技术检测林蛙嗜水气单胞菌

以感染嗜水气单胞菌的林蛙各组织脏器为抗原,以热灭活的嗜水气单胞菌为免疫原,免疫家兔制备兔抗嗜水气单胞菌血清为第一抗体,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG作为二抗,建立了间接荧光抗体试验方法.分别采用2.5%戊二醛5 min、甲醇10 min、冷丙酮1 h 3种固定方法固定抗原,然后滴加不同稀释倍数的兔抗嗜水气单胞菌血清、羊抗兔IgG-FITC,于荧光显微镜下观察.结果表明,2.5%戊二醛固定腹水5 min,兔抗血清抗体效价为 1:80,荧光二抗的最佳稀释倍数为1:4000.     

格氏乳球菌分离株的血清同源性及血清学检验

以分离于病(死)牙鲆(Paralichthys olivaceus L.)的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的代表菌株(T030817-1株),分别制备全菌(OK)及热处理(121℃作用1h)菌体(O)免疫原,强化免疫接种家兔制备相应抗血清,对10株格氏乳球菌分离株进行了血清同源性检验。结果表明,供试10株菌均存在同种的表面K抗原和同种的菌体O抗原(血清同源),其中O抗原具有强免疫原性、K抗原免疫原性及O凝集抑制阻断作用弱;以相应OK抗血清为第1抗体、标准的羊抗兔IgG荧光抗体为第2抗体,对10株格氏乳球菌的纯培养物及用代表菌株(T030817-1)人工感染病死牙鲆的肝组织进行了间接荧光抗体染色,结果显示了特异的荧光反应;同时,对从人工感染死亡牙鲆分离的6株纯培养菌以凝集试验进行了检验,亦显示特异凝集反应。     

应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌——鳗弧菌

以花鲈（Lateolabrax japonicus)弧菌病的病原菌-鳗弧菌（Vibrio anguillarum)W-1为抗原，制备兔抗血清；利用异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白（FITC-IgG）为荧光标记二抗，并以罗丹明标记的牛血清白蛋白为背景染色，建立检测鳗弧菌的间接荧光抗体快速检测技术。应用该技术对人工感染后的花鲈组织（肌肉、鳃、肠、肾）样品和养殖水体样品进行了鳗弧菌检测，结果显示间接荧光抗体技术不仅可以用于诊断发病的感染花鲈，也可用于检测带菌状态或未发病的感染花鲈。     

海产蟹类血卵涡鞭虫病间接荧光抗体快速检测技术

以寄生于三疣梭子蟹血淋巴中的血卵涡鞭虫虫体为抗原,制备了多克隆血清抗体。抗体经健康梭子蟹血淋巴吸附处理后,间接ELISA检测效价达7680。应用该抗体建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。采用常用显微镜检、PCR及 IFAT三种方法对采集的养殖青蟹、梭子蟹、及海捕梭子蟹等18个样本进行了检测。检测结果显示：常规显微镜检阳性检出率为33.3%,而IFAT及PCR检测阳性率77.8%,符合率达100%;阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血细胞则未被染色;可检测到血卵涡鞭虫不同生活阶段的营养体、腰鞭孢子及合孢体阶段。本文为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法。     

抗犬瘟热高免卵黄抗体IHA检测方法的建立

目前检测卵黄抗体的方法很多,但IHA方法具有简便快速的优点,本研究的目的是为了建立抗犬瘟热高免卵黄抗体检测方法。采用犬瘟热病毒和犬细小病毒二联疫苗处理作为疫苗抗原,用犬瘟热病死犬的肝脏部分处理后作为组织抗原,制备敏化绵羊红细胞,用IHA方法确定了犬二联疫苗抗原和犬瘟热病毒组织抗原的最适含量。二联疫苗提取抗原的含量为0.7 mg/mL致敏红细胞时,与犬瘟热单克隆抗体反应显著,抗体效价为1∶256;而患犬瘟热松狮犬的肝脏组织抗原蛋白浓度为0.5mg/mL,与犬瘟热单克隆抗体反应显著,抗体效价为1∶128。经过IHA验证,制备的松狮犬瘟热肝组织抗原,蛋白含量0.5 mg/mL 1%致敏红细胞,对应的单抗、鸡血清均出现了凝集,阳性对照也出现凝集,阴性对照未出现凝集。建立的IHA抗体检测方法,为准确检测制备抗犬瘟热高免卵黄抗体的效价奠定了基础。     

海产蟹类血卵涡鞭虫间接荧光抗体快速检测技术

以寄生于三疣梭子蟹血淋巴中的血卵涡鞭虫虫体为抗原,制备了多克隆血清抗体.抗体经健康梭子蟹血淋巴吸附处理后,间接ELISA检测效价达7 680.应用该抗体建立了血卵涡鞭虫的间接荧光抗体检测技术(IFAT).采用常规显微镜检、PCR及IFAT 3种方法对采集的养殖青蟹、梭子蟹及海捕梭子蟹等18个样本进行了检测.检测结果显示:常规显微镜检阳性检出率为33.3%,而IFAT及PCR检测阳性率77.8%,符合率达100%;阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血细胞则未被染色;可检测到血卵涡鞭虫不同生活阶段的营养体、腰鞭孢子及合孢体阶段.为血卵涡鞭虫的流行病学调查及生活史研究提供了简便实用的方法.     

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1琼脂扩散试验(AGP):利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散,若抗原抗体对应,且二者比例合适,在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线.每对抗原抗体可形成一条沉淀线.有几对抗原抗体,就可分别形成几条沉淀线.琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型.单向扩散是一种定量试验.可用于免疫蛋白含量的测定.而双向扩散多用于定性试验.由于方法简便易行,常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分.     

酶联免疫吸附测定试剂盒使用中出现的问题和解决方法

自从1971年Engvall等发表了酶联免疫吸附测定(enzyme linked i mmunosorbent as-say,ELISA)用于IgG定量测定的文章后,使1986年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测量方法,即当今广泛使用的ELISA技术。酶联免疫吸附分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术主要的依据有三点:第一、抗原(抗体)能结合到固相载体的表面仍具有其免疫活性;第二、抗体(抗原)与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性;第三,结合物与相应的抗体(抗原)反应后,结合的酶仍能催化…     

牡蛎诺如病毒受体类Lewis抗原合成相关基因CgFUT5的克隆与表达鉴定

Lewis抗原被认为是诺如病毒特异性结合受体,作为诺如病毒传播载体,牡蛎中也存在着类Lewis抗原,但牡蛎合成这种碳水化合物的途径尚未阐明。为解析牡蛎中诺如病毒受体类Lewis抗原的合成路径,利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆得到太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的CgFUT5基因全序列并进行生物信息学分析,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析其在5种组织中的表达情况。构建原核表达质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)实现异源表达,并通过免疫印迹法(Western blot)鉴定免疫原性。克隆得到了具有1 173 bp开放阅读区的CgFUT5基因cDNA序列,系统发育树显示CgFUT5基因与多个物种具有合成Lewis抗原功能的岩藻糖基转移酶基因遗传学关系较近。重组CgFUT5蛋白可在大肠杆菌中过量表达,且表达的重组CgFUT5蛋白与抗人FUT5抗体及抗6×His标签抗体均能特异性结合。研究发现CgFUT5基因在牡蛎鳃组织中大量表达,CgFUT5蛋白与人FUT5蛋白具...     

血卵涡鞭虫单克隆抗体的制备与初步应用

用血卵涡鞭虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经常规融合、间接ELISA方法筛选,将所得阳性克隆再经3次亚克隆后,共获得3株针对血卵涡鞭虫的单克隆抗体(2B₂、3G₄、4G₇),单克隆抗体亚类鉴定表明,三者为IgG类抗体。用筛选的杂交瘤细胞株制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为5.12×10^-4和8.00×10^-4。进一步利用单克隆抗体建立间接荧光抗体方法对单抗特异性进行鉴定,阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血淋巴则未被染色。用单克隆抗体和多克隆兔抗血清以羊抗鼠HRP-IgG为酶标抗体,建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法,该方法对血卵涡鞭虫阳性标本检测符合率为100%。结果表明,制备的单克隆抗体效价高、特异性好,可用于血卵涡鞭虫的早期临床诊断。     

提高兔抗血清制备量的措施

<正>抗血清即免疫血清或高免血清,是指含有对某一特异性抗原起作用的抗体的血清。是用同一种抗原物质(菌苗、疫苗、类毒素等)反复多次注射动物体后,机体体液中尤其是血清中产生大量抗体,待抗体效价达到实验要求时,采集全血,析出的血清即为我们所需要的抗血清。制备血清需要一     

疑集试验中常见问题的产生原因及解决办法

随着人们对动物源性食品质量卫生安全要求的日益提高和动物防疫检疫工作的需要,实验室检验成为基层动物防控机构的必要技术手段.而细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性的颗粒抗原,当与相应抗体结合,在有电解质存在时,抗原与抗体结合形成凝集团块,即称为凝集试验.凝集试验中的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素.凝集试验主要包括直接凝集试验和间接凝集试验,其共同特征是操作简便,反应快速,敏感性高;缺点是容易发生非特异性反应.所以在做凝集试验时,必须设置阴性血清、阳性血清和生理盐水等对照.以排除非特异性凝集.     

牙鲆迟钝爱德华氏菌血清型及荧光抗体检验

以迟钝爱德华氏菌的代表菌株(HC010907-1)为免疫原,制备免疫血清,对分离于牙鲆鱼的130株迟钝爱德华氏菌进行了血清型检定,结果表明:供试的130株迟钝爱德华氏菌均为同种血清型;同时以此免疫血清为第一抗体,以标准羊抗兔IgG荧光抗体为第二抗体,进行了荧光抗体技术检验迟钝爱德华氏菌的可行性试验,表明亦具有较强的特异性。     

渔业生物学

951336 大菱鲆抗鳗弧菌抗原的抗体产生动力学=Kinetics of antibody production againstVibrio anguillarum antigens in turbot[刊,英]/Estévez J,Leira J//Aquae..—1994,123(3/4).—191～196作者将鳗弧菌(ATCC 菌株19264)细胞添加或不添加弗洛因德佐剂对大菱鲆进行腹腔内接种,观察鱼体内抗体产生的变化情况.采用酶联接免疫吸着剂测定法(ELISA)观察抗体产生情况,该方法用在本实验室生产的抗大菱鲆 Ig 单克隆抗体以及三种细菌抗原制品(全细胞:全细胞提取物和 O-抗原)。试     

日本研究成功河豚毒素抗体

日本东大农学部的桥本周久教授和助手渡部终五等,已研究成功河豚毒素单克隆抗体。因抗体和抗原的结合尚不十分牢固,还不能使河豚毒完全无毒化。但今后可设法改变其结构.制成抗体,供河豚中毒者救命之用。河豚毒素分子量较小,为319。为了能够象认识抗原那样认出抗体,需要将其分子量变成数千以上。因此,渡部等用河豚毒素的诱导体,使毒性很低的河豚毒     

牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位

以牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）为抗原免疫Balb/c小鼠，而后将小鼠脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合，以囊肿组织冰冻切片的免疫荧光染色筛选杂交瘤细胞，阳性结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分，且多个荧光信号相连呈现链圈状，有限稀释 法克隆阳性杂交瘤细胞，三次克隆后获得4株稳定产生抗LCDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株（1A8、1D7、2B6、2D11）。应用Western-blotting法分析单抗识别蛋白的分子量，结果显示，单抗1D7 和2B6均能特异性结合一条分子量116 kD病毒多肽；应用免疫电镜技术定位单抗识别的抗原决定簇，结果发现胶体金颗粒集中吸附在病毒粒子衣壳周围，且背景清洁，无散在的金颗粒或其他污染物。实验结果说明分子量约为116 kD的蛋白多肽为LCDV病毒衣壳蛋白，且具有线性抗原决定簇。     

缩短血凝、血凝抑制实验时间的探讨

根据国家标准,禽流感和新城疫抗体检测实验采用血凝和血凝抑制试验进行检测,血凝实验检测抗原的4单位抗原,即抗原效价测定,血凝抑制试验检测抗体。整个实验过程耗时比较长,特别是检测量大的时候经常要加班不说,对于企业会投入更多的人力和物力,增加企业的成本。为了缩短实验时间,降低成本,提高检测效率,通过这几年的不断比对实验和总结,简述缩短实验检测时间的体会,供同仁参考。     

鳗鲡拟指环虫的免疫原性

拟指环虫病是严重危害养殖鳗鲡(Anguilla sp.)的寄生虫病,为了寻求更为安全有效的免疫防治方法,对鳗鲡拟指环虫(Pseudodactylogyrus spp.)的结构蛋白及其免疫原性进行分析。以鳗鲡拟指环虫全虫蛋白为抗原,制备了鼠和鳗鲡抗拟指环虫免疫血清,ELISA检测效价分别为1∶51 200和1∶3 200。SDS-PAGE分析表明,虫体含有16 kD、21 kD、29 kD、37 kD、43.5 kD6、8 kD和110 kD等主要结构蛋白,其中29 kD的多肽为高丰度蛋白;Western blot证实免疫鳗和康复鳗血清均能识别25 kD、43.5 kD6、2 kD、81 kD等虫体蛋白。间接荧光抗体试验显示,个别虫体在头部、尾部有明显的荧光染色,大多数虫体中部两侧,特别是卵黄腺丰富区域,呈较强的荧光染色。