水牛BMP1基因对颗粒细胞增殖与凋亡的功能研究

本研究旨在探讨BMP1基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖与凋亡的影响,采用qRT-PCR检测体外培养0、24、48、72和96h水牛颗粒细胞中BMP1基因的表达规律,通过在水牛颗粒细胞培养液中添加BMP1基因重组蛋白和抗BMP1抗体,观察其对体外培养水牛颗粒细胞增殖变化的影响,并应用qRT-PCR和Western blotting方法检测与细胞增殖和细胞凋亡相关因子表达的变化规律。结果显示,随着颗粒细胞体外培养时间的延长,BMP1基因的相对表达量显著上调(P0.05),96h培养组BMP1表达最高。添加BMP1重组蛋白可显著促进水牛颗粒细胞的体外增殖(P0.05),并能够显著上调细胞周期关键蛋白Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA mRNA表达水平(P0.05),同时显著抑制了细胞凋亡信号通路中促凋亡相关因子(Fas、FasL、TNFR1、TNF-α、Cytochrome C、Apaf1、Chop、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9)mRNA表达(P0.05)。Western blotting检测结果表明,BMP1重组蛋白能够抑制Fas、Bax和Caspase-9蛋白表达,蛋白与mRNA表达一致。而添加抗BMP1抗体的试验则得出相反的结果。综上表明,BMP1基因能通过调控相关基因的表达促进体外培养水牛颗粒细胞的增殖并抑制其凋亡,在水牛卵泡发生过程中具有重要的调控功能,为阐明BMP1基因参与家畜卵泡发生的分子机制奠定基础。     

骨形态发生蛋白基因mRNA在牛卵巢组织中的表达研究

骨形态发生蛋白(BMP15)基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用.研究根据其他物种BMP15基因的保守序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术,从牛卵巢中提取总RNA,扩增出BMP15 cDNA序列;将此片段克隆到pGM-T载体中,经PCR鉴定和DNA序列测定分析验证,符合BMP家族基因结构特征,然后根据此序列构建cRNA探针,利用原位杂交技术检测牛卵巢BMP15基因 mRNA的表达情况.原位杂交结果显示,牛BMP15基因,在初级卵泡和次级卵泡早期表达,在初级和次级卵泡的颗粒细胞中也表达,在次级卵泡晚期也有表达,同时BMP15基因在透明带周围表达,这可能是透明带周围细胞中的BMP15基因渗透到透明带中.     

骨形态发生蛋白基因mRNA在牛卵巢组织中的表达研究

骨形态发生蛋白(BMP15)基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。研究根据其他物种BMP15基因的保守序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术,从牛卵巢中提取总RNA,扩增出BMP15cDNA序列;将此片段克隆到pGM-T载体中,经PCR鉴定和DNA序列测定分析验证;符合BMP家族基因结构特征,然后根据此序列构建cRNA探针,利用原位杂交技术检测牛卵巢BMP15基因mRNA的表达情况。原位杂交结果表明:牛BMP15基因,在初级卵泡和次级卵泡早期、初级和次级卵泡的颗粒细胞次级卵泡晚期都有表达,同时BMP15基因在透明带周围也表达,这可能是透明带周围细胞中的BMP15基因渗透到透明带中。     

影响哺乳动物繁殖行为的主要效应基因

在绵羊中发现的影响其生殖行为的几个主要效应基因都是转化生长因子β(transforming growth factor TGFβ)超家族成员:骨形态生成素蛋白15(bone morphogenetic protein 15B MP15),BMP15也称为GDF9b,生长分化因子9     

骨形态发生蛋白15(BMP15)通过Smads信号通路促进雏鸡原始卵泡的激活

骨形态发生蛋白15(BMP15)在卵巢发育中发挥着重要的调节作用,然而,BMP15对雏鸡原始卵泡发育的作用尚不清楚。本试验研究了BMP15对雏鸡原始卵泡发育的影响。结果表明,BMP15和BMP受体-IB(BMPR1B)mRNA的表达变化以及BMPR1B蛋白的表达变化时间点与原始卵泡的激活时间点一致。BMP15通过促进卵母细胞和颗粒细胞的增殖和抑制细胞的凋亡来激活原始卵泡的活化,这种效应可被BMPR1B的抑制剂ML347所抑制(P<0.05)。电镜观察表明,BMP15处理可增加卵泡内卵母细胞与颗粒细胞之间的缝隙连接。与此同时,Smad1、Smad5和Smad4信号通路参与了BMP15的作用过程。以上结果表明,BMP15通过Smad1、Smad5和Smad4信号通路参与雏鸡原始卵泡的激活。     

GDF9/BMP15对卵泡发育的调控

卵母细胞及其紧密连接的卵泡细胞之间的精细调节,促使卵母细胞成熟、受精和胚胎发育.在卵泡发育过程中,除了下丘脑-垂体-性腺轴间的内分泌调节外,卵母细胞源旁分泌或自分泌因子维持发育卵泡内微环境稳态,调节卵母细胞成熟和颗粒细胞增殖.目前发现,这些关键的调控因子主要是TGFβ超家族成员中的生长分化因子-9 （GDF9）和骨形态发生蛋白（BMP15）.GDF9/BMP15主要表达于卵母细胞,是卵泡发育必需的细胞因子.论文综述了GDF9/BMP15的结构特点、表达特性、信号通路及其在卵巢中的生物学作用等研究进展.     

哺乳动物卵泡颗粒细胞体外培养研究概况

卵泡颗粒细胞在卵泡的发育过程中起着重要作用,在卵泡颗粒细胞的增殖分化同时又受到多种生殖激素和细胞因子的调节。卵泡颗粒细胞作为研究动物生殖生理的一种理想的细胞模型,作者对哺乳动物卵泡颗粒细胞的体外培养及其在动物生殖生理中的作用作一简要概述。     

8个繁殖相关基因在利用羔羊超排技术获得的FecB杂交羊卵巢颗粒细胞上的差异表达分析

家畜的繁殖性状是畜牧业重要的经济性状之一,FecB基因是公认的多胎主效基因。本试验以布鲁拉美利奴羊与新吉细毛羊杂交一代为研究对像,对不携带FecB基因(++型)和携带FecB基因杂合型(B+型)的1月龄母羊超数排卵后,采用手术法进行活体采集卵泡液,收集并培养卵巢颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR分析++型和B+型卵巢颗粒细胞上BMPR-1B、BMP15、GDF9、GnRHR、LHR、FSHR、ESR、AMH共8个基因表达情况。结果显示:++型和B+型卵巢颗粒细胞的BMPR-1B、GnRHR、LHR、FSHR基因mRNA表达水平差异不显著(P0.05);B+型卵巢颗粒细胞的BMP15、AMH基因mRNA表达水平显著高于++型(P0.05), GDF9、ESR基因mRNA表达水平极显著低于++型(P0.01),ESR基因mRNA表达水平显著高低于++型(P0.05)。本试验对利用羔羊超排技术获得的FecB杂交羊卵巢颗粒细胞繁殖相关基因的表达状况进行了分析,进一步明确了利用羔羊超排技术获得的卵母细胞体外成熟阶段的发育环境,为探讨FecB杂交羊对羔羊超排技术的应答机制、优化卵母细胞体外培养技术提供参考。     

蒙古羊BMP15和GDF9基因多态性与其产羔性能相关研究

以控制Belclare 和Cambridge 绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15 (bone morphogenetic protein 15 ,BMP15) 基因和生长分化因子9 (growth differentiation factor 9 , GDF9)基因为候选基因,采用PCR-SSCP 技术检测BMP15和GDF9 基因在蒙古羊中的单核苷酸多态性,同时研究这2个基因对蒙古羊繁殖力的影响.结果表明在蒙古羊品种中都没有检测到GDF9 基因的G8 突变(C →T) ,也没有检测到BMP15 基因的B4 突变(G →T),在所检测的116个蒙古羊个体中,BMP15 基因在B1位点均呈现多态性,具有++、+A和AA 3种基因型.测序分析表明:该段DNA序列中存在3个碱基的缺失,即编码区第28,29,30位碱基缺失,使其10号氨基酸残基亮氨酸(L)缺失,变成了突变基因型(AA),形成B1突变体;群体遗传学分析表明,B1突变在双羔系中的发生频率高于单羔系中发生的频率,χ2适合性检验结果表明两品系在该位点具有中度多态性并处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);与产羔性能关系分析表明B1突变对蒙古羊产羔数无显著影响(P>0.05).     

过表达和干扰GDF9基因对番鸭颗粒细胞凋亡和周期的影响

实验旨在探究生长分化因子9(Growth Differentiation Factor,GDF9)基因对番鸭颗粒细胞的影响，本研究构建了GDF9过表达载体（pEX-2-GDF9）以及干扰GDF9小RNA (siRNA-GDF9-530、siRNAGDF9-978、siRNA-GDF9-1320)，分别转染至原代番鸭颗粒细胞内，通过流式细胞术检测GDF9基因对细胞周期和凋亡的影响；荧光定量PCR技术检测转染后颗粒细胞周期和凋亡相关基因的表达量。结果显示，过表达GDF9基因将番鸭颗粒细胞阻滞在G0/G1期，S期细胞极显著减少，且Bax基因和Caspase-3基因表达量极显著（或显著）上调，说明过表达GDF9促进了颗粒细胞凋亡；干扰GDF9基因表达后，G0/G1期细胞极显著减少，S期细胞极显著增加，且CDK-2、Bcl-2、CCND1 mRNA极显著上调，CCNE1 mRNA显著上调。综上可知，GDF9基因表达促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞周期进程。该结果可为番鸭的卵泡发育机制研究提供理论基础。     

黔北麻羊生长分化因子9和骨形态发生蛋白15基因遗传变异分析

试验将生长分化因子9(GDF9)基因和骨形态发生蛋白15(BMP15)基因作为候选基因,采用直接测序法检测GDF9和BMP15基因在黔北麻羊中的单核苷酸多态性。结果表明,在GDF9基因外显子2的562 bp处发生了突变(A→C),导致谷氨酰胺突变为脯氨酸,检测到AA、Aa 2种基因型,基因型频率分别为0.7273、0.2727;A、a等位基因频率分别为0.8637、0.1363。BMP15基因外显子2的480 bp处发生了突变(C→G),导致谷氨酰胺突变为谷氨酸,检测到BB、Bb 2种基因型,基因型频率分别为0.7000、0.3000;B、b等位基因频率分别为0.8500、0.1500。     

生长分化因子8在哺乳动物中的功能研究进展

转化生长因子β(TGF-β)超家族成员在卵母细胞成熟和卵丘细胞(CCs)扩增中起关键作用,其中研究确认比较早的有卵母细胞分泌的生长分化因子9(GDF9)、骨形成蛋白15(BMP15)等.而TGF-β超家族的新成员生长分化因子8(growth differentiation factor 8,GDF8),又称肌肉生长抑制...     

BMPMP3、BMPBMP10、BMPBMP15基因在雏鸡和成年鸡主要器官中的表达特性研究

骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子超家族中的重要成员,其信号通路控制着诸如中胚层形成、神经系统分化、牙齿和骨骼发育以及癌症发生等许多重要的生物学过程。研究旨在分析BMP家族中的BMP3、BMP10、BMP15在雏鸡和成年鸡主要器官中表达水平。采用RT-PCR方法分析BMP3、BMP10、BMP15在雏鸡、成年鸡主要器官中的表达情况,并分析这3个基因在雏鸡和成年鸡心脏中的表达差异性。结果表明:BMP3、BMP10在雏鸡和成年鸡两阶段主要器官中均可表达,BMP15在成年鸡母鸡各器官均有表达,公鸡仅肝中有表达;BMP3在雏鸡心脏中表达水平显著高于成年鸡(P0.05),BMP10表达水平两者差异不显著(P0.05),BMP15在成年鸡表达水平显著高于雏鸡(P0.05)。研究结果为BMP信号通路研究提供参考。     

山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果, CCK-8检测细胞的增殖效果。结果显示:分离培养的山羊卵巢卵泡颗粒细胞经促卵泡素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,阳性率为95%;慢病毒感染颗粒细胞时荧光蛋白的表达占比80%;qPCR验证FST过表达和干扰慢病毒载体的效果均显著(P0.05);过表达FST显著(P0.05)抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,干扰FST显著(P0.05)促进卵巢卵泡颗粒细胞增殖。笔者分离出山羊卵巢卵泡颗粒细胞,成功构建FST过表达和干扰两种慢病毒载体,感染结果表明FST能够抑制山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,为进一步研究FST在哺乳动物卵泡发育调控中的作用及其机制提供了基础资料。     

生长分化因子9与卵泡发育研究进展

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF-9)属于TGF-β超家族,其在卵泡的发育过程中发挥着重要的作用。作者将对GDF-9基因的结构和功能,GDF-9的表达与调控及其对卵泡发育和颗粒细胞增殖的影响等方面进行详细的阐述,进而分析GDF-9基因与哺乳动物繁殖性能的关系。     

BMP15对藏鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响

为探究骨形态发生蛋白15(Bone Morphogenic Protein 15,BMP15)对体外培养的藏鸡等级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响，研究体外分离、培养并鉴定藏鸡等级卵泡F1颗粒细胞后，用0、25、50、100 ng/mL四种不同浓度的BMP15蛋白单独处理或者联合25 ng/mL促卵泡素（FSH）处理细胞，72 h后采用ELISA法检测不同处理组细胞培养液中的孕酮含量。同时，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测不同处理组细胞中孕酮合成关键基因StAR、CYP11A1和HSD3B1 mRNA相对表达量。结果显示：免疫组化法鉴定体外分离培养的藏鸡F1卵泡颗粒细胞卵泡刺激素受体（FSHR）抗体阳性率95%以上；BMP15单独处理细胞后，随着BMP15浓度的升高，孕酮分泌量呈下降的趋势，且100 ng/mL处理组的孕酮分泌量极显著低于其他组（P<0.01）;BMP15联合FSH处理细胞后，随着BMP15浓度的升高，孕酮分泌量呈现上升的趋势，其中100 ng/mL处理组的孕酮分泌量极显著高于其他组（P<0.01）；不同处理组细胞中孕酮合成关键基因StAR、CYP1...     

小鼠棕色脂肪转基因过表达miR-155损坏棕色脂肪细胞的分化

为探究microRNA-155(miR-155)对小鼠棕色脂肪组织分化的影响,收集广泛过表达miR-155的转基因小鼠(RL-m155小鼠)棕色脂肪组织,离体棕色脂肪大体拍照,然后收集部分组织固定、石蜡包埋和切片,并行HE染色,观察棕色脂肪细胞的大小和形态;同时RT-qPCR检测棕色脂肪组织中分化相关基因的表达水平。结果表明,RL-m155小鼠的体重、体型与对照小鼠无显著差异;与对照小鼠相比,RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155表达水平显著升高,而棕色脂肪组织体积及棕色脂肪细胞的大小均显著减小;棕色脂肪中特异表达基因(UCP1和SCA-1)、棕色脂肪分化调控因子(BMP2、BMP6、Smad1、Smad5、C/EBPB、MYO10和PTEN)、棕色脂肪分化诱导因子(PPARγ、PGC-1α、BMP2、BMP4、BMP7、BMPR1A和Sirt1)等棕色脂肪分化相关功能基因的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。表明RL-m155小鼠棕色脂肪组织中miR-155过表达,导致棕色脂肪组织分化受损。     

miRNA调节卵泡颗粒细胞凋亡及其机制的研究进展

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码RNA,具有广泛的基因表达调控作用,可以在转录后水平通过影响靶基因来调控相应蛋白质的表达,进而调节细胞的生命活动。miRNA在哺乳动物卵泡颗粒细胞中表达,并调控颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞作为卵巢卵泡中数量最多的细胞群,在卵泡发育过程中起着至关重要的作用,不仅为卵母细胞提供营养物质,还调控其发育和成熟。颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,影响卵泡的数量和质量从而影响雌性动物的繁殖性能。颗粒细胞凋亡过程受多种因素的调控。文章简述了miRNA对卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用及其机制,其中包括miRNA通过调控激素分泌和细胞凋亡相关因子的表达进而调节颗粒细胞的凋亡,miRNA对颗粒细胞凋亡相关信号通路的影响,miRNA调控颗粒细胞凋亡导致的卵巢相关疾病,并总结了对颗粒细胞凋亡有调控作用的miRNA,以及miRNA在疾病诊断和治疗中的潜在作用,以期为后续相关卵巢疾病的发病机制和治疗方案研究,以及提高雌性哺乳动物生殖性能提供指导和参考。     

三倍体虹鳟卵巢发育中细胞凋亡与发育相关基因的表达

为了研究三倍体雌性虹鳟在生长过程中出现的性腺发育停滞、卵原细胞发育异常的原因,试验采集180~300 dpf时期二倍体和三倍体虹鳟的性腺组织,利用光镜、电镜切片和TUNEL染色进行组织与细胞学对比研究,利用实时荧光定量PCR分析对卵巢发育和配子发生过程发育具有调节作用的生长分化因子9(GDF9)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和骨形态发生蛋白7(BMP7)在二、三倍体相同时期的表达差异。结果表明:180~300 dpf虹鳟三倍体卵巢中的卵原细胞发生凋亡,除240 dpf三倍体虹鳟BMP4表达量显著高于二倍体外,三倍体虹鳟中GDF9、BMP4和BMP7表达量显著低于同时期二倍体。说明三倍体虹鳟卵原细胞发育异常,最终发生凋亡,可能与GDF9、BMP4和BMP7的低表达有关,BMP4在调节卵母细胞发育的同时可能有抑制细胞凋亡的作用。     

BMP15-FAT1对猪卵丘细胞凋亡的影响

猪卵丘细胞位于卵母细胞外周,作为一种特殊的颗粒细胞,参与卵母细胞发育、卵泡发育与闭锁以及胚胎的生存和发育等重要生殖生理过程。为探求BMP15通过调控卵丘细胞增殖与凋亡,进而影响卵母细胞生长及成熟的作用机制,本研究通过体外添加BMP15,利用RNA干扰技术、实时荧光定量PCR、流式细胞术等方法,分别检测了添加BMP15后,猪卵丘细胞凋亡情况及凋亡相关通路基因的m RNA表达变化。结果表明:猪BMP15由卵母细胞特异性分泌,可抑制猪卵丘细胞凋亡,同时也可促进FAT1基因的表达;沉默FAT1基因后,BCL2/BAX比率下降,进而影响猪卵丘细胞的凋亡。