PCR-DGGE技术在土壤微生物多态性研究中的应用

实验室中传统的微生物分离、培养和分类方法,在反映土壤微生物的基因信息上有很大的局限性,将逐步被分子生物学方法所替代。本文在阐述PCR-DGGE方法原理的基础上,分析了其在微生物多样性研究中的具体运用、方法缺陷及改进措施。     

用PCR-DGGE研究菌肥对西藏青稞土壤微生物群落多样性的影响

为探讨微生物菌肥对西藏青稞土壤根际微生态的影响,利用传统纯培养与PCR-DGGE(聚合酶链式反应- 变性梯度凝胶电泳)技术相结合的方法,研究了谷特微生物菌肥不同施用方式和施肥浓度对西藏青稞根区土壤微生 物量和细菌群落结构的影响.结果表明,与对照相比,施肥处理显著降低了土壤真菌数量(p<0.05),土壤放线菌 数量和微生物量氮含量显著上升(p<0.05).DGGE分析表明,菌肥处理土壤与未施菌肥土壤的细菌群落结构存在 明显差异,土壤微生物区系结构发生了改变;DGGE所反映的土壤细菌多样性可以用来判断菌肥发挥作用的程度, 合理指导菌肥的施用.本研究中,菌肥的施入促进了土著细菌Acidobacteria、Actinobacteria 和Bacillus 的生长,抑 制了土壤中Blastomonas、UnculturedRhizobium 和Cyanobacterium 的生长.两种施肥方式,根施对青稞根区土壤 中细菌、真菌和放线菌数量的影响较叶面喷施大,根施对土壤微生物区系的改变较叶面喷施高,根施最佳菌肥施用 量为20.0mL/hm2,叶面喷施最佳菌肥施用量为26.7mL/hm2.本研究为准确预测和评价微生物菌肥的施用效果 提供了技术参考.     

PCR-DGGE技术在智能化沼气池微生物多样性研究中的应用

采用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术研究智能化上流式沼气池微生物群落结构的动态变化。结果表明:沼气池中微生物种类丰富,并且拥有优势种群,主要有:稳杆菌属、热单细胞属、杜檊氏菌属、戈登氏菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌门、变形菌门的α类群和厌氧细菌门。各细菌种类不同发酵层、不同发酵时间对微生物多样性存在影响。DGGE图谱中的优势条带16SrDNA基因序列经比对后都属于不可培养细菌。说明利用PCR-DGGE技术研究智能化沼气池中微生物多样性是可行的。     

基于PCR-DGGE技术的剑湖湿地湖滨带土壤微生物群落结构多样性分析

为了解剑湖湿地湖滨带植物根际土壤中细菌的群落结构特征多样性,应用PCR-DGGE 技术对剑湖湿地湖滨带4种植物根际土壤细菌的群落结构进行了研究,根据 DGGE 指纹图谱,对它们的遗传多样性进行了分析。结果表明,不同植物群落根际和非根际土壤细菌多样性指数（H′）、丰度（S） 和均匀度（J）均有所不同,根际土壤细菌多样性指数、均匀度、丰富度均高于非根际,其中茭草根际土壤细菌多样性指数、均匀度、丰富度均最高,说明植物群落类型与土壤微生物多样性的关系十分密切;不同植物群落根际土壤细菌群落结构相似性较高,非根际土壤细菌群落结构相似性较低,在82%的相似水平上聚为4大类群,根际土壤细菌和茭草非根际土壤细菌聚为一类,其余非根际土壤细菌各聚为一类,说明植物群落对微生物群落结构具有一定的影响。对 DGGE 的优势条带序列分析,同源性最高的微生物分别属于变形菌门（Proteobacteria）、草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）、紫色杆菌属（Janthinobacterium）、杜擀氏菌属（Duganella）、埃希氏菌属（Escherichia）和链球菌属（Streptococcus）,它们均为未培养微生物。不同植物群落根际土壤氮磷含量均有所差异,其中茭草根际土壤氮磷含量最高,湿地土壤细菌多样性与土壤有机质、总N、总P的含量呈正相关关系,土壤细菌多样性与土壤pH值呈负相关关系。     

研究土壤微生物多样性的PCR条件优化

[目的]对PCR-DGGE法的试验条件进行优化,以更好地分析土壤微生物遗传多样性。[方法]改良高盐法提取土壤DNA,改进引物设计,改变PCR反应过程中退火温度、扩增体系,比较PCR扩增结果。[结果]经过改良的高盐法提取的土壤微生物DNA效果更好。PCR扩增选择20μl体系条带单一,易于操作。退火温度选择在55℃时无非特异性扩增,35个循环次数易于后续DGGE分析。[结论]已经优化的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

研究土壤微生物多样性的PCR条件优化(英文)

[目的]对PCR-DGGE法的试验条件进行优化,以更好地分析土壤微生物遗传多样性。[方法]改良高盐法提取土壤DNA,改进引物设计,改变PCR反应过程中退火温度、扩增体系,比较PCR扩增结果。[结果]经过改良的高盐法提取的土壤微生物DNA效果更好。PCR扩增选择20μl体系条带单一,易于操作。退火温度选择在55℃时无非特异性扩增,35个循环次数易于后续DGGE分析。[结论]已经优化的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

PCR-DGGE方法解析大豆根际不同距离的土壤细菌群落多样性特征

应用根箱法及PCR-DGGE技术对两个大豆基因型的苗期根际不同距离的细菌群落多样性进行研究。结果表明,在距根面0～2mm的范围内,细菌群落丰富度和Shannon指数相对较高,根际细菌的多样性优于非根际（〉10mm）,主成分分析和聚类分析证明根际与非根际土壤的细菌群落多样性特征存在差异。不同基因型间苗期根际细菌群落多样性未发现显著差异。     

双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性的PCR-DGGE分析

将采自青岛市沿海潮间带的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis(体质量为4～5 g)置于无菌海水中暂养24 h后,分别从5条双齿围沙蚕消化道中提取微生物基因组总DNA,应用细菌16S rDNA通用引物341f/534r进行细菌16S rDNA基因V3高变异区的PCR扩增,再将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),从而获得样品消化道共栖微生物群落特征的DNA指纹图谱。通过对指纹图谱半定量分析发现,采集的双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性丰富,优势条带明显,不同个体间既存在共同的微生物种属,也有各自特异的种属。其中存在一条共同的优势条带,但优势条带含量存在个体间差异。分别对DGGE指纹图谱中公共条带序列进行测序比对,结果表明,产丙酸菌属Propionigenium分别为5个样品中的优势菌群,假交替单胞菌属Pseudoalteromonas广泛分布于双齿围沙蚕消化道中。研究表明,基于16S rDNA的PCRDGGE图谱技术是分析双齿围沙蚕及其他海洋沉积食性无脊椎动物消化道微生物菌群结构较为有效的手段。     

双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性的PCR-DGGE分析

将采自青岛市沿海潮间带的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis(体质量为4～5 g)置于无菌海水中暂养24 h后,分别从5条双齿围沙蚕消化道中提取微生物基因组总DNA,应用细菌16S rDNA通用引物341f/534r进行细菌16S rDNA基因V3高变异区的PCR扩增,再将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),从而获得样品消化道共栖微生物群落特征的DNA指纹图谱。通过对指纹图谱半定量分析发现,采集的双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性丰富,优势条带明显,不同个体间既存在共同的微生物种属,也有各自特异的种属。其中存在一条共同的优势条带,但优势条带含量存在个体间差异。分别对DGGE指纹图谱中公共条带序列进行测序比对,结果表明,产丙酸菌属Propionigenium分别为5个样品中的优势菌群,假交替单胞菌属Pseudoalteromonas广泛分布于双齿围沙蚕消化道中。研究表明,基于16S rDNA的PCRDGGE图谱技术是分析双齿围沙蚕及其他海洋沉积食性无脊椎动物消化道微生物菌群结构较为有效的手段。     

利用PCR-DGGE技术快速检测鉴定饲用微生物

针对目前国内外对饲用微生物添加剂中多种微生物的检测缺乏简捷有效手段这一现实状况,通过PCR-DGGE方法建立了地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、粪肠球菌Enterococcus faecalis、植物乳杆菌Lactobacillus planta-rum、干酪乳杆菌Lactobacillus casei4种标准菌株的分子指纹图谱,建立了一套这4种微生物的快速同步检测技术,并用该检测技术对市场上一种饲用微生物添加剂进行分析,结果判定其含有6种优势菌群,包括植物乳杆菌和干酪乳杆菌.本技术还可以推广应用到目前国家允许添加的其他16种饲用微生物的检测,为饲用微生物添加剂产品质量监控提供了技术支撑.     

微量金属元素添加频率对牛粪厌氧发酵特性的影响

为研究微量金属元素对牛粪厌氧发酵特性的影响,每隔1,3,5,7d向牛粪厌氧发酵液中添加Fe、Co、Ni元素。结果表明,7d添加1次微量金属元素的发酵组效果最佳,产气率和总产气量最高,COD去除率最高;每1d添加1次的挥发性有机酸(VFA)和产气量都最低,分析认为微量金属元素添加频率过高会破坏反应器内的营养平衡。     

禽畜粪便厌氧发酵产气特性研究

为研究不同畜禽粪便厌氧发酵产气特性,通过批次厌氧发酵实验分类分析5种畜禽粪便的成分、沼液变化及产气规律。结果表明,畜禽粪便碳氮比为6.03~13.43,发酵过程中5种畜禽粪便沼液pH值基本维持在6~7.5,且氨氮浓度小于1500 mg?L_^-1。畜禽粪便发酵周期在47~55 d,出现两个日产气量高峰,且第二个产气高峰(160~393.5 mL)明显高于第一个(137~200 mL)。研究表明,畜禽粪便不存在氨氮抑制,可作为发酵原料。     

应用PCR—DGGE技术研究四角蛤蜊的细菌多样性

应用PCR—DGGE技术对盘锦某滩涂四角蛤蜊Mactra venerformis体内的细菌多样性进行了分析。使用SDS裂解法提取样品的总DNA,采用大多数细菌通用引物F338GC／RS18从总DNA中成功扩增出16SrDNA片段,然后对PCR产物进行DGGE分析,并将DGGE图谱上部分条带回收、再扩增、克隆和测序：将所测序列在GenBank核酸数据库中进行检索,用BLASTN分析DNA序列获得相似性最近的细菌。DGGE图谱显示,四角蛤蜊体内的细菌种类比较丰富,且不同时间样品细菌的优势菌群结构有一定的差异。将所测条带序列进行比对,结果表明,细菌种群中包括支原体属Mycoplasma、假单胞菌属Pseudomonas、弧菌属Vibrio、红球菌属Rhodococcus和鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas及不可培养的细菌。     

畜禽粪便与秸秆混合发酵及贮藏阶段沼液中碳氮元素变化

为研究沼液从产生到贮藏期间碳氮元素的变化规律,将猪粪、鸡粪和秸秆混合,进行中温厌氧发酵,并在常温下以密闭静置、密闭搅拌、敞口静置、敞口搅拌等4种方式贮藏沼液,跟踪并分析了猪、鸡粪和秸秆混合发酵沼液在厌氧发酵及贮藏期间碳、氮元素的形态和含量变化。结果表明:厌氧发酵阶段,沼液中的总有机碳(TOC)和总氮(TN)浓度均有所增加,增加幅度在15.0%~36.1%之间,其中TOC在第18 d达到最高浓度(6467 mg·L~(-1)),TN在第23 d达到最高浓度(4181 mg·L~(-1))。贮藏阶段,沼液中的TOC、TN浓度均有所降低,TOC先下降后升高,总体降低幅度较小(2.9%~12.0%),降幅顺序为敞口静置敞口搅拌密闭静置密闭搅拌;TN先升高后降低,总体降低幅度较大(4.2%~56.2%),降幅顺序为密闭静置密闭搅拌敞口静置敞口搅拌。综上,厌氧发酵18~23 d的沼液碳氮元素含量最高,采用密闭静置方式并缩短贮藏时间可减少沼液贮藏过程氮元素的损失。     

接种量对牛粪分离液厌氧发酵特性影响

利用研制的螺旋挤压分离机对稀释的牛粪进行分离,在中温(35±2)℃条件下,对分离液按照不同接种量(占发酵有效容积体积百分数为10%、20%、30%、40%、50%)进行厌氧发酵试验,发酵周期为20 d,以VS(Volatile solid)产气率、COD(Chemical Oxygen Demand)去除率为考察指标,...     

餐厨垃圾猪粪混合厌氧发酵研究

为解决我国餐厨垃圾污染环境,资源化利用程度低的问题,本研究通过试验将餐厨垃圾与猪粪混合发酵。得到餐厨垃圾与猪粪混合厌氧发酵的最佳原料比例为1:1.5,得到餐厨垃圾与猪粪混合厌氧发酵的最佳搅拌频率为60r/min,餐厨垃圾与猪粪混合厌氧发酵的最佳温度为38°C,餐厨垃圾与猪粪混合厌氧发酵的最佳时间为10h,餐厨垃圾与猪粪混合厌氧发酵的最佳pH为7。为我国餐厨垃圾资源综合利用提供参考。     

猪粪厌氧发酵消化液回流体系微生物群落结构特征与产气关系研究

为明确厌氧发酵消化液回流体系中微生物群落结构的特征,采用Miseq高通量测序技术,研究回流过程中微生物的多样性和群落结构变化,并分析其与产气性能的关系。结果表明:消化液回流体系中,细菌的丰富度、多样性均高于产甲烷古菌,并随回流时间的延长明显增加,而产甲烷古菌无明显变化;细菌群落主要分为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)等8个不同的门类,厚壁菌门、梭菌纲(Clostridia)、梭菌属(Clostridium)是不同水平上的优势细菌,相对丰度分别从初期的62.79%、58.62%、35.44%上升到81.46%、68.19%、39.10%;产甲烷古菌中,广古菌门(Euryarchaeota)占绝对优势,在接种物中,第68 d和第219 d相对丰度分别为94.76%、99.89%、99.59%,属分类上主要有7种,其中甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)的相对丰度由23.99%升高到72.28%,而甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)和甲烷球菌属(Methanosphaera)分别由16.34%、21.71%降低至3.70%、12.93%;日平均产气率由初期的409 m L·g~(-1)升高至477 m L·g~(-1),在219 d的试验中,氨氮和有机酸浓度均呈升高趋势,但并未对厌氧发酵产生抑制作用。研究表明:厌氧发酵回流体系中微生物以梭菌属和甲烷八叠球菌属为优势菌属,产气率随其相对丰度的增大而升高,而与甲烷短杆菌属和甲烷球菌属呈负相关。     

外源磺胺二甲嘧啶对施用粪肥的菜地土壤中微生物群落多样性的影响

【目的】明确磺胺二甲嘧啶(SM2)随粪便施入土壤对土壤微生物群落造成的影响,为合理进行养殖场周围土壤环境质量评估和施肥管理提供参考依据。【方法】收集养殖场附近未经抗生素污染的粪便和土壤,构建粪便–土壤模型,设置不同SM2添加剂量的处理,分别为对照组(0)、低剂量组(5μg·kg~(-1))、中剂量组(500μg·kg~(-1))和高剂量组(5 000μg·kg~(-1)),并分别于粪便和SM2施入1、7、14和50 d后采集土壤样品,采用Biolog技术以及磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)标记法对比分析不同处理组土壤微生物群落的碳源利用能力、菌群结构和功能多样性变化。【结果】SM2的施入提高了土壤微生物群落的总体碳源利用能力,中、高剂量组在施入50 d时对除酯类以外的其他碳源利用能力均强于对照组。低剂量组在施入7 d内对各类碳源利用能力增强,中、高剂量SM2的施入可能会影响土壤群落某些优势物种的繁殖和数量分配。随施入时间的延长,土壤微生物群落对不同剂量SM2反应不同,革兰阳性菌、革兰阴性菌以及真菌数量变化显著,放线菌变化不明显。【结论】SM2的施入将长期影响土壤微生物群落的结构与功能多样性。养殖场应及时处理动物排泄物以消除抗生素残留,减少粪肥对土壤环境造成的生态破坏。