泰和乌骨鸡鸡胚皮肤黑色素细胞的分离与培养

为探讨泰和乌骨鸡鸡胚皮肤黑色素细胞的分离、培养及鉴定方法,取20日龄的泰和乌骨鸡鸡胚的背部皮肤,通过不同的消化酶处理皮肤分离乌骨鸡黑色素细胞,细胞培养于改良型的α-MEM完全培养液中,对黑色素细胞进行形态学观察,并通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察黑色素细胞的生长情况,用多巴染色和抗S-100免疫细胞化学染色法对培养的细胞进行鉴定。结果表明,用Dispase+胰蛋白酶消化皮肤可获得较好的分离效果,倒置显微镜下观察细胞呈树突状。培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和霍乱霉素(CT)可协同促进黑色素细胞的生长。MTT结果显示细胞生长良好,多巴和抗S-100蛋白染色呈阳性。本试验成功从20日龄泰和乌骨鸡鸡胚背部皮肤中分离得到黑色素细胞,经形态学观察、多巴和免疫细胞化学染色鉴定为黑色素细胞。     

α-黑素细胞刺激素对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响

旨在研究α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响,初步探讨α-MSH调控泰和乌骨鸡黑色素合成的机制。利用体外培养的乌骨鸡皮肤黑色素细胞,观察不同质量浓度α-MSH(0、2.5、5、10 mg/L)及其拮抗剂([D-Trp7,Ala8,D-Phe10]α-MSH(6-11)-amide,D-AD-MSH)处理后黑色素细胞增殖、黑素皮质素受体1(melanocortin 1receptor,MC1R)基因表达、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量和黑色素含量的变化。结果表明,不同质量浓度的α-MSH对细胞有促增殖的作用,2.5mg/Lα-MSH处理组细胞的增殖率极显著高于不添加α-MSH的对照组(P0.01)。α-MSH剂量依赖性地提高MC1R基因表达。2.5mg/Lα-MSH处理组细胞cAMP的含量显著高于对照组(P0.05),其他处理组之间差异不显著(P0.05)。不同浓度的α-MSH处理均极显著提高细胞TYR活性(P0.01或P0.05)。与对照组相比,2.5mg/Lα-MSH极显著提高皮肤黑色素细胞的黑色素含量(P0.01),5、10.0mg/Lα-MSH具有提高黑色素细胞黑色素含量的趋势(P0.05)。α-MSH拮抗剂D-A-D-MSH预处理乌骨鸡皮肤黑色素细胞显著抑制α-MSH对黑色素细胞MC1R基因表达、cAMP含量、TYR活性和黑色素含量的上调作用(P0.05)。α-MSH能促进泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖,提高MC1R基因表达、cAMP含量以及TYR活性并进而促进黑色素合成。     

乌骨鸡黑色素细胞体外原代培养及鉴定

旨在建立乌骨鸡黑色素细胞体外培养和鉴定的方法,为研究黑色素细胞功能提供理想的生物材料。本研究选取乌骨鸡腹膜组织,采用DispaseⅡ和胰酶-EDTA混合消化法,经严格控制不同培养阶段的消化时间,对黑色素细胞进行纯化和传代,获取了乌骨鸡黑色素细胞。通过观察各个培养阶段的细胞形态和细胞生长曲线,表明在专用培养基条件下,细胞增殖良好。根据细胞形态特征、电镜下的亚细胞结构、黑色素合成相关基因的表达分析、DOPA染色和细胞免疫化学染色鉴定,表明所获得的细胞符合黑色素细胞特征。细胞经传代后培养至第10代,仍保持了正常的生物学特性,说明所建立的培养体系可以实现乌骨鸡黑色素细胞体外原代培养。综上表明,本研究成功建立了乌骨鸡黑色素细胞体外分离培养体系。     

水貂被毛黑色素含量及皮肤成熟黑色素细胞组织学分析

旨在分析水貂被毛黑色素含量差异及观察皮肤成熟黑色素细胞的分布特征,为水貂毛色形成调控机理研究提供理论依据。以乌贼黑为标准品,利用酶标仪测定并比较金州黑水貂、银蓝水貂和吉林白水貂被毛总黑色素(Total melanin,TM)、真黑色素(Eumelanin,EM)及褐黑色素(Pheomelanin,PM)含量;通过甲苯胺蓝、多巴及多巴联合甲苯胺蓝分别对不同毛色水貂皮肤组织进行染色。结果表明,金州黑水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分别是换毛期的1.17和1.20倍(P0.01),EM含量显著高于换毛期(P0.05);银蓝水貂换毛期与毛皮成熟期被毛3种黑色素含量差异不显著(P0.05);吉林白水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分别是换毛期的1.27和1.22倍(P0.05)。组织学染色显示,金州黑和银蓝水貂皮肤中均存在成熟黑色素细胞,主要分布于金州黑水貂的表皮和毛囊顶端,毛囊外根鞘和毛纤维髓质层有少量多巴阳性着色带;银蓝水貂皮肤的表皮和毛囊顶端多巴阳性着色带较少,毛囊外根鞘阳性着色较浅;吉林白水貂皮肤组织未见明显多巴阳性着色区域。综上表明,PM含量可能与水貂灰色和白色被毛表型相关,毛囊顶端的成熟黑色素细胞可能是水貂被毛色素沉积的主要细胞。     

乌骨鸡皮肤黑色素细胞的原代培养及鉴定

为探讨获得大量高纯度乌骨鸡黑色素细胞不同方法的优劣,以及进一步研究乌骨鸡黑色素细胞生物特性及其黑色素的生物合成,以1周龄乌骨鸡雏鸡腹侧皮肤作为黑色素细胞来源,采用胰蛋白酶、中性蛋白酶和胶原酶Ⅰ消化进行细胞产量和贴壁效率评估,杂细胞用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)选择性消除,最后细胞长期培养在添加胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、TPA和实验室自制活性肽的DMEM基础培养基中。利用多巴染色法、透射电镜对获得细胞的性质进行鉴定。结果显示,胶原酶Ⅰ较中性蛋白酶和胰蛋白酶消化分离获得的黑色素细胞具有更高细胞产量和细胞活力,原代培养5d后,达到融合,未见角质形成细胞和成纤维细胞污染。因此,采用胶原酶Ⅰ消化并使用添加多种刺激因子的培养基,可建立乌骨鸡黑色素细胞的有限细胞系。     

不同生长阶段泰和乌骨鸡体内黑色素含量比较测定

试验选用健康、初生重相近(31.56±0.16)g的1日龄泰和乌骨鸡45只,随机分成A、B、C 3组,每组15只。试验分3个阶段饲养,即0~4、5~8、9~12周。通过饲养试验、屠宰试验,测定了泰和乌骨鸡不同周龄的体重、平均日增重、平均日采食量和料重比及3个生长阶段胸肌、腿肌和皮肤中的黑色素含量。结果显示:①泰和乌骨鸡在8周龄以后虽然平均日采食量在增加但平均日增重逐渐减少,而料重比明显增加,其生长曲线呈现出先慢—后快—再慢的"S"型趋势,符合生长规律。②随着日龄的增长,泰和乌骨鸡无论是腿肌、胸肌还是皮肤的黑色素含量都逐渐减少,但差异不显著(P>0.05)。其次,在同一生长阶段泰和乌骨鸡组织中的黑色素含量也不同,其中腿肌和皮肤中的黑色素含量要高于胸肌中的黑色素含量,但3种组织中的黑色素含量均无显著差异(P>0.05)。     

不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的组织学分析

羊驼是已知家养动物中天然被毛颜色最为丰富的动物之一,本研究旨在在组织水平上观察不同被毛颜色羊驼皮肤组织中成熟黑色素细胞的分布与定位,以揭示羊驼丰富被毛颜色发生的细胞学机制。试验选择白色被毛和有色被毛成年羊驼各1头,盛毛期体侧取样,制备石蜡切片,分别采用多巴染色、甲苯胺蓝染色及多巴—甲苯胺蓝复染,光镜观察、拍照。结果表明,在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中均有成熟黑色素细胞的分布,但是分布规律不同,在有色被毛皮肤组织主要分布于毛根成形部,在毛根永久部及表皮也有分布,但是数量较少;白色被毛组织主要分布于表皮,在毛根成形部分布很少,而在真皮部及毛根永久部有少量分布。结果提示:1)羊驼不同被毛颜色发生取决于毛根成形部成熟黑色素细胞的数量;2)从一个侧面佐证了毛囊黑色素细胞与皮肤黑色素细胞在执行功能以及它们所接受的调节信号是不同的。     

日粮酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸水平和比例对泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响

本试验旨在研究日粮酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸供给水平和比例对泰和乌骨鸡生产性能和组织黑色素含量的影响.选用612只1日龄泰和乌骨鸡,随机分成17个处理,每个处理设3个重复,每个重复12只鸡(公母各占1/2),饲养至4周龄.采用三因素二次回归正交组合设计试验方法,建立日粮三种氨基酸水平与泰和乌骨鸡日增重和组织黑色素含量的二次回归数学模型,得出0～4周龄泰和乌骨鸡分别取得最大日增重和组织黑色素含量时日粮三种氨基酸适宜供给量和比例模式.结果表明,日粮酪氨酸,苯丙氨酸和色氨酸供给水平和比例显著影响泰和乌骨鸡日增重和胸肌、腿肌黑色素含量(P<0.01),且泰和乌骨鸡取得最大日增重和组织黑色素含量时日粮三种氨基酸最适水平和比例模式各不相同.当日粮氨基酸含量分别为酪氨酸0.79%、苯丙氨酸1.06%和色氨酸0.13%,三者比例模式为Tyr:Phe:Trp=85:113:14(相对于日粮Lys含量的比值,Lys定为100)时,可取得最大日增重5.81 g/d;而当日粮三种氨基酸含量分别为酪氨酸0.81%、苯丙氨酸1.14%和色氨酸0.13%时,胸肌黑色素含量可取得最大值3.73%,三者最佳比例模式为Tyr:Phe:Trp=87:121:14.因此,通过调节日粮酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸供给水平和比例可改善泰和乌骨鸡生产性能以及体内黑色素的沉积.     

日粮酪氨酸水平对9～12周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响

试验旨在研究日粮酪氨酸水平对9～12周龄泰和乌骨鸡生产性能、游离酪氨酸含量和组织黑色素含量的影响。选用56日龄泰和乌骨鸡270只,随机分成6组,每组设3个重复,每个重复15只鸡,饲养至12周龄。6个处理组日粮酪氨酸水平分别为0.45%、0.65%、0.85%、1.05%、1.25%和1.45%。结果表明:泰和乌骨鸡平均日增重、料重比随着日粮酪氨酸水平的提高先增加后降低,在1.05%水平时的平均日增重最大,料重比最低且与0.45%水平组差异极显著(P0.01)。此外,酪氨酸水平极显著(P0.01)影响平均日采食量。泰和乌骨鸡血清及组织中游离酪氨酸含量随日粮酪氨酸水平的提高先增加后降低。心脏、肌肉、皮肤组织中游离酪氨酸的含量在1.25%水平时达到最高,且与0.45%水平组差异极显著(P0.01);而血清和肝脏组织中游离酪氨酸的含量在0.85%水平时达到最高。组织中黑色素含量随着日粮酪氨酸水平的提高先增加后降低。肝脏、肌肉、皮肤中黑色素的含量在1.05%水平时达到最高且与0.45%水平组差异极显著(P0.01);而心脏组织中黑色素的含量在1.25%水平达到最高。在一定的酪氨酸水平范围内,提高日粮酪氨酸水平可提高泰和乌骨鸡血清及组织中游离酪氨酸含量、组织中黑色素的含量和生产性能。     

日粮添加硒对5～8周龄泰和乌骨鸡生产性能及黑色素含量的影响

试验旨在研究日粮硒添加水平对5～8周龄泰和乌骨鸡生产性能及组织黑色素含量的影响。选用5周龄初始体重无显著差异(P>0.05)的乌骨鸡216只(公母各半),采用完全随机分组设计,随机分成6组,分别饲喂在基础日粮中添加0、0.10、.3、0.5、0.70、.9 mg/kg硒的试验日粮,每组设3个重复,每个重复12只鸡。试验期为4周。结果表明:日粮添加0.5 mg/kg硒显著降低泰和乌骨鸡料重比(P<0.05),显著提高日增重(P<0.05)。肝脏、肾脏、胸肌和皮肤黑色素含量随硒添加水平的提高呈先上升后下降的趋势。其中,当日粮硒添加水平为0.5 mg/kg时,肝脏和胸肌黑色素含量达到峰值,当日粮硒添加水平为0.3 mg/kg时,肾脏和皮肤黑色素含量达到峰值。玉米-豆粕型基础日粮中添加硒可改善5～8周龄泰和乌骨鸡生产性能和提高组织黑色素含量,且日粮硒适宜添加水平为0.3～0.5 mg/kg。