苹果异戊烯基转移酶基因家族（MdIPTs）的克隆与MdIPT5a功能分析

 【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）异戊烯基转移酶（isopentenyltransferase,IPT）基因家族MdIPTs,分析MdIPT5a的生理功能,为深入研究MdIPTs在苹果细胞分裂素生物合成途径中的作用和基因的遗传转化提供理论依据。【方法】以‘富士’苹果为试材,利用RACE和苹果基因组信息克隆MdIPTs;利用洋葱表皮和拟南芥原生质体的瞬时表达研究MdIPT5a的亚细胞定位;通过农杆菌介导法遗传转化‘W38’烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）过量表达MdIPT5a,RT-PCR鉴定转基因烟草。【结果】克隆了10个MdIPTs的cDNA序列,其中7个编码细胞分裂素生物合成主要途径中的腺苷-IPTs,具有N端的保守结构域GxxGxGK[S,T]序列,分别位于苹果第13、16、3、11、13、16、6号染色体上,命名为MdIPT1a、MdIPT1b、MdIPT3a、MdIPT3b、MdIPT5a、MdIPT5b和MdIPT7a,均无内含子,编码284—370个氨基酸。MdIPT5a-GFP融合蛋白定位于细胞质中,但不定位于质体内。过量表达MdIPT5a的转基因烟草组培苗生根困难、叶片和不定芽增多。【结论】苹果中腺苷-异戊烯基转移酶基因具有成对高度同源现象,与苹果17条染色体起源于9条始祖染色体的同源起源学说相一致,MdIPT5a具有催化合成细胞分裂素的功能。     

苹果腺苷-异戊烯基转移酶基因的组织表达分析

为深入研究MdIPTs基因在苹果细胞分裂素合成途径中的作用和利用转基因技术改良苹果树型,分析苹果(Malus×Domestica Borkh.) A-IPTs基因的时空表达,本研究以 ''富士’苹果(M.Domestica Borkh.cv.Fuji)及其组培苗为试材,利用半定量RT-PCR方法分析7个A-IPTs基因在梢尖、幼叶、茎段节间、皮部组织、叶芽、花芽、花蕾、花、幼果和根部的表达水平。结果表明:MdIPT3a总体表达水平最高、MdIPT1b次之,在所检测的器官组织中均有表达;MdIPT5a在花蕾和花中表达量高,MdIPT5b在梢尖和幼叶中表达量高;MdIPT1a在根、皮部组织和叶芽中检测到微弱表达,MdIPT3b仅在组培苗的茎段中节间微弱表达;所检测的组织器官中未检测到MdIPT7a表达。苹果7个A-IPTs基因具有组织表达特异性,高度同源的成对基因的组织表达模式不同。     

特异性启动子在异戊烯基转移酶基因转化中的应用

综述了特异性启动子在异戊烯基转移酶基因转化中应用的研究进展,分析了存在的问题,并对今后的研究提出了建议。     

异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶的生物信息学分析

对来源于多种植物和其他生物的IPI蛋白特性、亚细胞定位及其亲缘关系等方面进行生物信息学分析和电子预测,为研究IPI家族蛋白的酶学特性和萜类生物合成的分子机理提供一定的理论依据。     

猕猴桃果实特异表达异戊烯基转移酶基因植物表达载体的构建

以pBI121质粒为载体,将猕猴桃素基因启动子与ipt编码基因连接,构建猕猴桃果实特异表达ipt嵌合基因。     

滇龙胆异戊烯基焦磷酸异构酶 基因的克隆与表达分析

根据药用植物滇龙胆转录组异戊烯基焦磷酸异构酶基因(Gr IDI)序列,应用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆该基因开放阅读框(ORF),获得Gr IDI1和Gr IDI2两条序列,其Gen Bank登录号分别为KM879183和KM879184。生物信息学分析表明Gr IDI1基因ORF长708 bp,编码235氨基酸;Gr IDI1蛋白相对分子质量为27.10 ku,理论p I为5.01。该蛋白属于I型异戊烯基焦磷酸异构酶家族成员,可能定位于细胞质。该蛋白无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋(45.53%)和无规则卷曲(39.57%)构成。该蛋白具有其他IDI蛋白的活性位点、金属结合位点和保守结构域(NUDIX羟化酶结构域)。Gr IDI1蛋白与黄龙胆Gl IDI蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,Gr IDI1基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为53.11ku,与预期大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr IDI1基因主要在叶中表达。     

蜡梅异戊烯基焦磷酸异构酶基因CpIPI的克隆及表达分析

从蜡梅花cDNA文库中克隆得到1个蜡梅异戊烯基焦磷酸异构酶基因,命名为CpIPI.CpIPI基因的cDNA全长为1 297bp,其中最大ORF框长为879bp,编码292个氨基酸残基.CpIPI蛋白质的相对分子量为33.4kDa,理论等电点为6.86.生物信息学分析表明,蜡梅CpIPI蛋白属于典型的IPI蛋白,CpIPI基因是调控蜡梅萜类物质合成的关键基因.荧光定量分析结果表明,CpIPI基因在蜡梅的根中不表达,但是在茎、叶和花中都有表达,且在外瓣中的表达量最高.CpIPI基因在蜡梅不同花期的表达量具有不规律差异性.由此推测,蜡梅CpIPI基因可能参与与花器官形成发育相关的萜类物质的合成.     

橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达

克隆新疆野生橡胶草顺式异戊烯转移酶基因,对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究该基因的功能和植物体内天然橡胶合成分子机制奠定基础。采用同源克隆法结合RT-PCR技术获得目的基因,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。结果表明:该基因开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸,推测的蛋白分子质量为34.9ku,理论等电点为8.74;具有cis-异戊烯基转移酶的5个高度保守区,属于cis-IPPS superfamily蛋白家族;系统进化树表明,橡胶草顺式异戊烯基转移酶与短角蒲公英的亲缘关系最近;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。可见,利用RT-PCR技术从橡胶草叶片中克隆得到顺式异戊烯转移酶基因,成功构建原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到表达。     

转ipt基因四季海棠植株抗旱性分析

利用ipt重组表达载体质粒,通过农杆菌介导法建立了遗传转化体系,并筛选出四季海棠(Begonia semperflorens)转ipt基因植株。研究结果发现,在细胞分裂素的调控下,转基因植株的高度、叶片面积均有不同程度的减小,但根系长度增加;在渗透胁迫条件下,转基因植株体内脯氨酸含量和SOD活性都明显增加。通过温室栽种,发现在同等情况下转基因植株的耐旱性明显强于非转基因植株。     

黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)的克隆及特征分析

为了分析黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)在果实发育不同模式中的转录变化以及对不同激素的转录应答情况,对CsIPT2基因进行了克隆和序列分析,再利用荧光定量PCR技术分析该基因在黄瓜单性结实自交系EC1和非单性结实自交系8419s-1果实发育过程中的表达情况,并分析了CsIPT2对不同激素的应答反应。结果表明:CsIPT2基因全长843 bp,共编码280个氨基酸,蛋白空间结构模型与蛇麻IPT蛋白极其相似。该基因不仅在授粉后的黄瓜果实发育中表达量上调,而且在黄瓜天然单性结实前期和人工诱导的单性结实后期表达量均有增加,推测该基因在促进黄瓜果实发育过程中发挥着重要作用,同时也可能参与了黄瓜单性结实的调控过程。GA、ET、6-BA、ABA和NAA 5种激素都能够诱导该基因的上调表达。其中GA处理后3 h基因表达量最高,ET、6-BA、ABA和NAA诱导的表达峰值出现在处理后6 h。随着NAA处理浓度的增加基因的表达量上调幅度增大。     

短枝型苹果MdRGL基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

短枝型苹果SSH文库构建及相关基因表达分析

【目的】寻找苹果短枝型枝条形成相关基因,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术构建正反向苹果短枝型芽变枝条和正常型枝条差异表达cDNA文库,利用荧光定量RT-PCR验证文库中克隆的插入片段。【结果】从两个文库中共获得291个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在300—600 bp之间。利用GenBank的BLAST比对分析,其中126个表达序列标签（EST）找到了与之匹配的同源序列。获得的cDNA片段功能涉及代谢、转录、胁迫响应、转运、光合和信号转导;有165个EST片段未找到同源序列。对文库中EST序列进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示这些EST序列在短枝型芽变枝条与正常型枝条之间差异性表达。【结论】通过构建短枝型苹果正反向文库,得到一些与短枝型苹果枝条节间长度相关联的基因,这些基因可能对短枝型苹果枝条的伸长具有一定作用。     

基于高光谱苹果品种叶片铁含量估测模型

【目的】 在叶片水平上构建基于高光谱的苹果品种叶片铁素含量估测模型,为探寻实时、高效、无损的果树树体营养诊断提供技术途径。【方法】以苹果品种岩富10号为材料,测定岩富10号叶片光谱数据和铁素含量,采用光谱分析和相关分析法,筛选与叶片铁素含量相关性较强的光谱组合,利用偏最小二乘法构建苹果叶片铁素含量光谱估测模型。【结果】岩富10号苹果叶片一阶微分光谱与铁素含量的敏感波段为R′₉₉₀、R′_{1 113}、R′_{1 360}、R′_{1 408},相关系数最高为-0.698 9。对敏感波段两两进行加、减、乘、除运算,最优波段组合形式R′₉₉₀×R′_{1 048}与铁素含量相关系数为0.846 2。估测模型拟合度(R²)最高为0.827 5。【结论】苹果叶片一阶微分光谱组合与铁素含量显著相关(P<0.05),光谱组合能够明显提高其相关性,偏最小二乘法与逐步回归建模相比估算模型的精度更佳,可以用于苹果叶片铁素含量的光谱估算。     

飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析

 【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。     

Genomic organization and sequence polymorphism of a farnesyl diphosphate synthase gene in apples (Malus domestica Borkh.)

Primer pairs were designed to amplify the genomic DNA sequence of the farnesyl diphosphate synthase (FPPS) gene by PCR. The PCR products were sequenced, spliced and compared to the cDNA sequence in the GenBank (accession No. AY083165). The genomic sequence and intron-exon organization of FPPS1 gene in the apple cultivar ‘Fuji’ were thus obtained. The FPPS1 genomic sequence has been registered in the GenBank (accession No. HM545312). It has 11 introns and 12 exons. The sizes of 11 introns were 559 bp, 108 bp, 144 bp, 114 bp, 84 bp, 690 bp, 373 bp, 168 bp, 87 bp, 91 bp and 97bp, and their phases were 0, 1, 0, 0, 0, 2, 0, 0, 0, 0 and 0, respectively. The sizes of 12 exons were 111 bp, 25 bp, 116 bp, 87 bp, 117bp, 89 bp, 52 bp, 96 bp, 45 bp, 90 bp, 72 bp and > 12 bp, respectively. Gene sequence comparison results of five apple cultivars indicated that the development of apple superficial scald was not influenced by the mutations in the exon sequence of FPPS1 gene. A 6-bp repeat unit deletion mutation and many SNP mutations in the introns, mainly in the introns of one allele, were identified in the apple scald-resistant cultivar ‘Golden Delicious’. This is the first report on the genomic organization and coding region polymorphism of FPPS gene in apples and other fruit trees.     

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点（pI）为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,TKFPS 蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。     

Genomic structure and sequence polymorphism of E,E-alpha-farnesene synthase gene in apples (Malus domestica Borkh.)

Primer pairs were designed to amplify the genomic DNA sequence of the alpha-farnesene synthase (AFS) gene by PCR. The PCR products were sequenced, spliced and compared to cDNA sequences in the GenBank (accession No. AY182241). The genomic sequence and intron-exon organization of the AFS gene were thus obtained. The AFS genomic sequence has been registered in the GenBank (accession No. DQ901739). It has 6 introns and 7 exons, encoding a protein of 576 amino acids. The sizes of the 6 introns were 108 bp, 113 bp, > 1000 bp, 125 bp, 220 bp and 88 bp, and their phases were 0, 1, 2, 2, 0, 0, respectively. The sizes of the deduced amino acids of the 7 exons were 57, 89, 127, 73, 48, 83 and 99, respectively. The AFS protein contained three motifs: the RR(X8)W motif encoded by a sequence in exon 1, and the RxR motif and DDxxD motif encoded by two sequences in exon 4. After comparing the AFS genomic sequence (accession No. DQ901739) to the cDNA sequence (accession No. AY523409) in the GenBank, it was found that there were 6 single-nucleotide polymorphisms between the two sequences, four of which caused mutations at the amino acid level. Interestingly, one amino acid mutation (291R → RG) was found in the RxR motif, and further investigation is needed to determine whether the alpha-farnesene synthesis ability and superficial scald susceptibility of apples are influenced by this amino acid mutation and other mutations. __________ Translated from Acta Horticulturae Sinica, 2007, 34(4): 1003–1006[译自: 园艺学报]     

水稻耐热相关功能基因的克隆及其分子机理研究进展

水稻是全世界最主要的粮食作物之一,水稻产量的提高是解决人类口粮问题的关键。水稻喜温, 但温度过高会对水稻的生长及产量造成严重影响。随着全球气候变暖,水稻热害频发,严重限制了水稻的高产、 稳产,导致水稻产业受到较大影响。通过鉴定水稻耐热数量性状位点（Quantitative Trait Loci,QTL）,克隆相关 基因,并研究水稻耐热性状的分子机理,将水稻重要耐热相关基因应用于育种是最经济、最有效的策略。近年 来随着测序技术和功能基因组学的发展,水稻耐热分子机理的研究取得了较大进展。迄今为止,国内外科研人 员已通过不同的遗传群体鉴定了 80 个以上的水稻耐热相关 QTL,并通过正向或反向遗传学手段克隆了部分水稻 耐热相关基因,为水稻耐热分子育种提供了极具价值的研究成果。就水稻耐热相关 QTL 的鉴定、耐热相关功能 基因的克隆以及耐热相关分子机理研究等方面进行综述,以期为水稻耐热分子育种提供参考。     

Inheritance and Molecular Marker of Resistance to Bot Canker in Malus domestica

Apple bot canker[Botryosphaeria dothidea(Moug.)Ces.et de Not.]is distributed worldwide,resulting in a serious crop loss every year in apple(Malus domestica Borkh.)production.The resistance of each seedling derived from a hybrid population(Jonathan×Golden Delicious)was evaluated by disease index either from natural infection in the field or from inoculation with five isolates of B.dothidea,Ls1,Lw023,Lw048,Mx1,and Zz26.The inheritance of the resistance to bot canker was analyzed via frequency distribution analysis,and microsatellite and AFLP markers linked to the resistance loci were screened.From the binary frequency distribution patterns,it was found that the segregation ratio of resistant/susceptible genotypes infected by pathogen isolates Lw023 and Ls1 was 1:15:and that by Zz26 and Mx1 was 15:1.The variation of resistance was involved in the segregation of two to four alleles of major genes,the resistance was recessive when infected by Lw023 and Ls1.but was dominant when infected with Mx1 and Zz26.A microsatellite maker,CH02a04-450,and two AFLP markers,E-AG/M-GAC-280 and E-AGG/M-CTT-110,were identified,and their map distances to the resistance loci were 5.1,5.1 and 6.2 cM,respectively.The three markers are located in different linkage groups,while CH02a04-450 is on linkage group 2 or 7.E-AG/M-GAC-280 was successfully converted into SCAR 159.Finally.CH02a04-450 and SCAR159 were re-examined in inoculated segregation population and presented a good reliability on predicting phenotypes of resistance.