稻瘟病菌中HOPS复合体生物信息学分析及MoYpt7在MoVps41突变体中的定位分析

据报道,酵母中HOPS复合体参与囊泡融合及运输。本研究分别以酿酒酵母HOPS复合体各亚基氨基酸序列,通过BLASTp在稻瘟病菌数据库中搜索得到了6个酿酒酵母HOPS复合体各亚基的同源蛋白,我们通过生物信息学方法对稻瘟病菌6个HOPS复合体亚基的同源蛋白的理化特性、蛋白质结构域和进化关系进行了分析。基于稻瘟病菌98-06菌丝阶段和孢子侵染水稻CO39不同阶段转录组测序数据,分别选取稻瘟病菌内吞和外泌途径相关的基因,制作了表达模式图。此外,MoYpt7蛋白在其假定下游效应因子ΔMoVps41突变体中的定位研究表明MoVps41可能影响了液泡融合。     

巨峰葡萄Rs基因的克隆鉴定、序列分析与时空表达特征研究

探究白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,Rs)在巨峰葡萄果实发育中的潜在作用。对其序列进行结构及功能分析,并鉴定其在果实不同发育时期的时空表达特异性。采用生物信息学分析及qRT-PCR的方法,对巨峰葡萄Rs基因序列进行分析,并对其结构和亚细胞定位进行预测,以及分析果实不同时期不同组织的表达情况。克隆得到的Rs基因cDNA全长1 539 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸,预测蛋白分子质量42.88 ku,理论等电点(pI)为6.09,且该基因含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位点以及完整的芪合酶家族特征位点;蛋白互作预测发现,Rs和OMT2.1具有互作,后者可催化白藜芦醇生物合成紫檀芪;亚细胞预测结果表明,Rs基因主要在细胞质和叶绿体中表达;启动子分析发现,Rs基因表达可能受光照、MYB、真菌和激素的调控并存在一定的组织特异性。qRT-PCR表达分析显示,葡萄Rs基因在果皮和果肉中不同时期均有表达,但在花后25 d的青皮中表达量最高。结合Rs基因在白藜芦醇积累的作用,可以推测可能在果实发育前期的果皮中白藜芦醇有较高积累。巨峰葡萄Rs基因在进化过程中具有较高的保守性,其表达可能受环境、真菌和激素的调控且与OMT2.1具有互作效应。而且在不同的组织和时期存在一定的特异性。     

稻瘟病菌一假定α-甘露糖苷酶多克隆抗体的制备及应用

摘要：【研究目的】为检测α-甘露糖苷酶的表达及其可能的功能,制备了稻瘟病菌一假定α-甘露糖苷酶多克隆抗体,并探索其可能应用。【方法】将与-His标签融合的过量表达一假定α-甘露糖苷酶蛋白的稻瘟病菌转化子,在液体完全培养基中培养,收集其上清液,经Ni2+-NTA亲和柱纯化后,得到可溶的融合蛋白α-甘露糖苷酶-His。【结果】纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔,得到抗α-甘露糖苷酶蛋白的多克隆抗体,ELISA检测结果表明抗体效价达1：51200,特异性高。利用该多克隆抗体以ELISA方法检测并Western验证分析稻瘟病菌30个田间菌株培养液α-甘露糖苷酶的表达量。【结论】不同菌株α-甘露糖苷酶表达量有明显差异。进一步分析表明,菌株70-15接种水稻后,不同时期α-甘露糖苷酶的表达量差异明显。菌株间致病型等生物学和生理学差异可能与α-甘露糖苷酶表达的差异有关。     

玉米AGPL2蛋白多克隆抗体制备及时空表达分析

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。     

家蚕化学感受蛋白BmCSP8表达谱及多克隆抗体制备

为阐明昆虫化学感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)基因在昆虫不同组织部位和发育时期表达特性。运用半定量RT-PCR的方法分析了家蚕BmCSP8基因的时空表达谱。结果显示：（1）BmCSP8基因在雌、雄蛹中均表达,但在卵期不表达,在幼虫阶段,低龄期高于高龄期的表达量;（2）BmCSP8基因广泛分布于成虫身体各组织,但雌雄间的表达存在差异性,在主要感受器官触角中的表达量较低;运用重组BmCSP8蛋白成功制备兔多克隆抗体,Western-blot分析发现抗血清与触角蛋白发生特异性结合,为深入研究其生理功能打下基础。以上结果表明：BmCSP8基因可能参与了家蚕觅食的生理过程,且具有其他尚未明确的非嗅觉功能。     

水稻稻瘟病效应蛋白研究进展

稻瘟病是水稻最具破坏性的真菌性疾病之一。近年来的研究发现,由稻瘟病菌分泌的多种效应蛋白在稻瘟病菌侵染水稻过程中起到了重要的作用。本研究综述了稻瘟病菌效应蛋白的研究进展情况,着重介绍了几个重要的效应蛋白,同时阐述了效应蛋白在水稻细胞中的分泌及转运过程,以及效应蛋白在水稻细胞中的定位。这些可为研究稻瘟病的致病机理以及水稻的防御反应提供线索,同时为研究真菌病原菌与作物的相互作用,并为未来作物抗病改良和病害防控策略的制定提供参考。     

玉米大斑病菌StCHS6的基因结构及表达规律分析

为了阐明玉米大斑病菌几丁质合成酶基因StCHS6在病菌生长发育及致病过程中的作用,克隆并解析了该基因及其编码蛋白的结构特征,明确了该基因在病菌生长发育过程中的表达模式。在玉米大斑病菌1号小种菌株01-23中克隆StCHS6,利用生物信息学手段分析该基因的结构特征,并利用已有的病菌重要发育阶段的RNA-Seq数据库信息,明确该基因的表达模式。结果发现,StCHS6位于病菌基因组scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置,基因全长为3 584 bp,含有4个内含子和5个外显子;CDS序列大小为2 703 bp,编码900个氨基酸,脂肪指数为81.86,亲水性平均值为-0.178,等电点(PI)为8.36,不稳定指数为36.94,属于碱性稳定型蛋白;保守结构域分析表明,StCHS6蛋白含有几丁质合成酶催化结构域Chitin_synth_1和多个跨膜结构域;亚细胞定位分析推测该蛋白定位于细胞膜上;RNA-Seq数据分析表明,StCHS6在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉5个发育时期均有表达,但其表达量有所差异。以芽管时期的表达量为1,菌丝、分生孢子、附着胞和侵入钉时期的表达量分别为芽管时期的3.80,4.97,3.40,2.60倍。为阐明玉米大斑病菌StCHS6的基因结构特征、表达模式及功能奠定了基础。     

稻瘟病菌Subtilases家族生物信息学分析及其中一蛋白的分泌性检验

根据已有的研究结果推测稻瘟病菌Subtilases家族基因可能在其致病过程中具有重要的功能,本研究以进化理论为基础,结合一些生物信息学的软件对稻瘟病菌基因组中Subtilases家族基因进行了比较基因组、进化分析及功能域分析,分析了Subtilases家族对稻瘟病菌致病性的重要性,并推测家族中不同基因的结构、功能及参与的生理过程可能的异同之处,以基因MGG_07965.6为例,分析其可能具有的生物学功能,并通过实验的方法证实了其基因表达产物确是分泌蛋白。     

玉米大斑病菌StRTG2基因结构、原核表达及表达模式分析

为明确玉米大斑病菌StRTG2基因功能以及其在病菌不同发育时期的表达模式。利用酵母ScRTG2基因编码的氨基酸序列进行BlastP,在玉米大斑病菌中得到了其同源基因序列,将其命名为StRTG2;分别以玉米大斑病菌野生型01-23的全基因组DNA及cDNA为模板,对该基因进行克隆;利用生物信息学技术对该基因编码的蛋白StRtg2进行理化性质分析、结构域预测、亚细胞定位预测;利用MEGA 7.0对Rtg2进行进化关系分析;扩增目的片段的ORF序列,构建该基因原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21后,使用IPTG进行诱导表达;最后利用RNA-Seq数据库分析StRTG2基因在玉米大斑病菌关键生长发育时期(菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉)的表达模式。主要研究结果如下:克隆了该基因发现其长度为1 695 bp,不含有内含子;该基因编码的蛋白由564个氨基酸组成,理论等电点值(pI)是6.96,具有典型的Ppx-Gppa保守结构域,亚细胞定位预测结果显示,该蛋白在细胞各部位均有分布,分布于细胞质中的可能性最大;对该蛋白进行进化关系分析表明,玉米大斑病菌StRtg2蛋白与番茄匍柄霉菌中同源蛋白的同源性最高,其次是酿酒酵母;原核表达该基因,SDS-PAGE胶显示该蛋白的大小约为62 ku,与预期大小相符;表达模式分析发现,该基因在病菌发育的5个时期均有表达,其中芽管和侵入钉时期表达量显著降低。为进一步解析StRTG2基因的功能研究奠定基础。     

陆地棉ZF-HD蛋白的全基因组分析

ZF-HD(Zinc finger-homeodomain)蛋白属于同源异型盒蛋白家族,在动植物发育过程中起重要的作用。利用生物信息学的手段,研究陆地棉标准系TM-1基因组中ZF-HD蛋白的数目、亚细胞定位、染色体分布、基序、进化关系和组织表达情况。TM-1中共有35个Gh ZHD蛋白成员,且大部分成员定位到细胞核内;分布在20条染色体和2条Scaffold上,且具有11对直系同源基因;进化树分析表明,TM-1基因组中的ZF-HD蛋白大致分为6个小组,每个小组成员间具有类似的基序类型和排列顺序;大部分Gh ZHD基因在胚珠和纤维组织中表达,还有部分基因在根、茎、花、蕾和分生区中表达,在叶和愈伤组织中表达的基因最少。     

24个单基因系对黑龙江省优势菌群的抗性及联合抗病性分析

为了明确24个抗稻瘟病基因在黑龙江省的抗性水平及其利用价值,将2006年黑龙江省优势菌株和强致病力菌株接种于以丽江新团黑谷为轮回亲本培育而成的含有24个抗瘟单基因系上。结果表明：水稻抗瘟基因Pi9(t)、pi-z5对优势和强致病力菌株抗性最强,是较好的抗源可以广泛的利用;对2个抗瘟基因的联合抗病性系数分析,结果表明基因两两搭配后的联合抗病系数最高、联合致病系数最低的组合是pi-9(t)*pi-z5 和pi-9(t)*pi-ta2 ;分析得出,黑龙江省稻瘟病菌致病力较强,大部分抗瘟基因都已失去抗性,急需引进新的抗瘟基因。     

产几丁质酶细菌CHB101对稻瘟病菌的抑制作用

采用平板对峙及无菌滤液对稻瘟病孢子萌发影响等方法研究了产几丁质酶细菌CHB101对稻瘟病菌的抑制效果,结果表明该菌对稻瘟病菌有明显抑制作用,在PDA平板上25℃培养6d后抑菌带平均宽为11.0mm,并在显微镜下观察到了稻瘟病菌菌丝细胞质浓缩,细胞壁溃解和细胞质外渗等明显的几丁质酶作用现象。该菌培养后的无菌滤液对稻瘟病孢子萌发有强烈的抑制作用,并随滤液的浓度提高抑制作用越强。而且研究结果显示CHB101的抑菌谱宽,抑菌能力强。     

21个稻瘟菌株毒力与42个水稻品种抗瘟性的系统聚类分析

通过对42个水稻品种进行人工离体叶片接种,明确供试水稻品种对21个稻瘟菌株的抗普和病级并在此基础上对42个水稻品种抗瘟性作了初步研究。分别按供试21个稻瘟菌株毒力差异和42个水稻品种抗瘟性的多个抗性指标进行系统聚类分析。将供试稻瘟菌株分为七类,其菌株毒力差异显著,菌株毒性频率和平均毒力之间呈现高度负相关。把水稻品种分为七类,其中第三类的第一组抗性最好,抗普在85%~100%,病级4.0以下。结果对选育水稻抗瘟新品种、合理布局区内抗性水稻和防治稻瘟病爆发具有一定的实际意义。     

稻瘟病菌MGHSP90的生物信息学分析

为了探讨稻瘟病菌热激蛋白MGHSP90的结构特征和性质差异,本研究对MGHSP90热激蛋白进行了生物信息学分析,结果表明,MGHSP90为热激蛋白,属于亲水蛋白、无信号肽、不具有跨膜结构、N-末端具有ATP酶保守结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白定位于线粒体。磷酸化位点预测分析结果显示,MGHSP90热激蛋白预测到43个丝氨酸位点,24个苏氨酸位点和10个酪氨酸位点磷酸化位点。本研究为进一步研究稻瘟病菌热激蛋白MGHSP90基因的功能提供了一些参考依据。     

用SSR标记法对黑龙江省稻瘟菌无毒基因的检测

使用与无毒基因Avr-pit、Avr-pia、PRE1紧密连锁的3个SSR标记对黑龙江省不同地区的195个稻瘟菌菌株的DNA进行PCR扩增。结果表明,各无毒基因在黑龙江省的出现频率有明显差异,无毒基因Avr-pit的出现频率为43.59%,无毒基因Avr-pia出现频率36.92%,无毒基因PRE1的出现频率为30.26%。黑龙江省稻瘟病菌的群体结构复杂,在不同地区甚至相同地区的菌株中无毒基因的存在情况都有明显的差异。     

水稻分子育种亲本材料在东北地区的稻瘟病抗性评价

对212份分子育种亲本在稻瘟病重发区自然鉴定圃进行田间抗性鉴定,发现分别有117个和39个品种对叶瘟和穗颈瘟表现抗性,19个品种对叶瘟和穗颈瘟均表现中抗以上抗性,叶瘟与穗颈瘟发病严重度存在显著相关性.进一步利用辽宁和黑龙江的混合菌株在水稻苗期,对田间苗期和成株期均表现抗病的19个品种进行人工接种鉴定,分别筛选出对辽宁东...     

黑龙江省水稻品种对稻瘟病的抗性分析及评价利用

采用室内苗期抗谱鉴定的方法,选取178个稻瘟病菌株对黑龙江省13个主栽品种的抗稻瘟病进行了鉴定。从品种对整个黑龙江省稻瘟病菌株的抗性来看,龙粳14和龙盾104抗性最好,抗谱分别为93．82％和93．26％。从品种对适宜积温带稻瘟病菌株的抗性来看,绥粳7和龙盾104分别是第2和第3积温带抗瘟性最好的品种,抗谱分别为73．08％和95．40％。此外,还利用生物间遗传学关于联合抗病性分析的方法。分析了品种搭配在生产上的应用前景,联合抗病性系数最高的组合是龙稻7和绥粳7,联合毒性系数最低的组合是绥粳4和垦稻10。     

以茎尖分生组织为受体用农杆菌介导法转化激发子基因pemG1棉花植株的获得

为了解决棉花常规遗传育种周期长,农杆菌介导的转化下胚轴再生难,转化率低,胚变异率高等难题。通过改善茎尖的遗传转化,利用农杆菌介导法转化棉花茎尖,试图缩短转化周期,获得转化苗。构建了稻瘟菌激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-pemG1,分别以‘珂字312’、‘中棉24’棉花茎尖分生组织作为外植体,摸索无菌苗的最佳培养方案,确定最佳共培养温度、共培养时间及卡那霉素筛选浓度。经过共培养,茎尖在诱导芽培养基上诱导生芽,从不同浓度的BAP和NAA生长激素的组合中,最终确定0.1 mg/L的BAP和NAA最适合芽的诱导;经过两个月的继代培养,在含有GA3的茎增殖培养基上完成茎的增殖和延伸;切取幼芽并使其在含有0.1 mg/L的IBA生根培养基中生根;生根的抗性植株移栽到温室中成苗,获得了T0代转基因株系4株。进行了转pemG1阳性植株的初步验证。     

稻瘟病菌一个假定的漆酶基因功能分析

漆酶可能是病原真菌毒力因子之一。稻瘟病菌基因组共有16个假定的漆酶类基因,对其中的Mgg_00551.5进行了生物信息学和分子遗传学分析,以明确其功能。生物信息学分析表明该漆酶是具有3个多铜氧化酶结构域、可以分泌到胞外的蛋白。经基因敲除表明,Mgg_00551.5功能缺失突变体ΔMG0551-13的漆酶活性比野生型菌株稍低,但是其生长速度、产孢能力、致病性等方面与野生型菌株相比均无明显差异,可能是功能冗余所致。进一步的双突变或多突变可能是明确漆酶功能的重要方法。