苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适用于苹果叶片蛋白质组学研究的样品制备方法,比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法（TCA）、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和Tris-HCl提取法等3种总蛋白质的提取方法。制备的样品经双向电泳分离采用银染显色。结果3种方法分别得到450、374和1032个蛋白质点。认为Tris-HCl提取法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大。     

植物组织双向电泳样品制备方法研究进展

摘要：双向电泳是目前应用最广泛的蛋白分离技术,该技术的核心是蛋白样品的制备。植物组织中通常含有大量蛋白酶和次生代谢物,这严重干扰蛋白提取、分离和鉴定。从植物组织中提取高质量的蛋白样品用于蛋白组分析充满挑战,本文简要阐述了植物组织蛋白提取的关键点,特别是植物组织中的次生代谢物及去除方案。此外,本文还对三种植物蛋白提取方法、三种方法的优缺点及适用植物组织作了概述。     

新霉素单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用碳二亚胺(EDC)法将新霉素(NEO)偶联于载体蛋白BSA和OVA,合成免疫原BSA-NEO和包被原OVA-NEO,用红外扫描(IR)、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-NEO免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术建立分泌NEOmAb细胞株,用体内诱生腹水法制备NEOmAb;对NEOmAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定.结果表明,成功制备了BSA-NEO人工抗原;筛选出1E9、4E8、1G1共3株敏感特异的杂交瘤细胞,间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:2.56×103、1:1.28×103、1:5.12×103,腹水效价分别为1:5.12×105、1:2.56×105、1:1.02×106,1G1亲和常数(Ka)为3.75×1010(L/mol);1G1株对NEO的IC50为2.57 ng/mL,NEO mAb对庆大霉素、链霉素、土霉素、环丙沙星、二氟沙星等无交叉反应.试验获得了抗NEO高价、敏感、特异的mAb,可用于NEO残留检测的免疫学试验.     

水稻种子蛋白质组分的双向电泳分析

本文对双向电泳技术作了一些改进,应用于水稻种子胚乳及胚蛋白的组分分析,获得了较清晰而稳定的结果。水稻(Oryza sativa.L)品种珍汕97的胚乳蛋白可分析出约100种成分,而胚蛋白可分析出约550种成分,检测灵敏度为0.2μg 蛋白质/mm~2。通过对这些实验条件的比较,表明该技术对水稻等作物种子蛋白的分析是一种行之有效的方法。     

花生叶片蛋白质双向电泳的方法与优化

以花生品种鲁花14为试验材料,提取叶片可溶性蛋白进行双向电泳分析。在三氯乙酸/丙酮沉淀法的基础上,对样品抽提、样品溶解、胶条pH范围选择、蛋白上样量、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等关键步骤进行改进,获得了蛋白点较多、重复性好的双向电泳图谱,为开展花生叶片蛋白质组研究奠定了基础。     

木麻黄花粉变应原蛋白质组分的双向电泳分析

木麻黄(CasuarinaequisetifoliaLinn)为广东和华南沿海防护林及用材的优良树种。在最近的植物花粉过敏原调查中发现,木麻黄的花粉为中国东南沿海地区主要吸入性过敏原之一,开花季节会引起过敏人群产生哮喘、过敏性鼻炎等变态反应性疾病。目前,大约40%的过敏反应症状是由于接触特定的花粉后产生的,因此,当前有关花粉过敏原的研究都主要集中在花粉中特定致敏因子鉴定和分析上。为了解木麻黄花粉中的主要致敏因子,为今后花粉过敏反应的免疫治疗提供研究基础,本研究通过三氯乙酸(TCA)法提取木麻黄花粉总蛋白质,应用等电聚焦和第二向SDS-PAGE分析法获得完整的木麻黄花粉总蛋白图谱。结果表明:木麻黄花粉变应原中有85个不同的蛋白质组分,通过ImageMaster2D分析软件对获得的蛋白质图谱进行详细的全量蛋白质组分的量化分析,进一步确定木麻黄花粉蛋白质的等电点分布主要集中在4.5￣5.5之间,分子量分布集中在10￣30kD之间,各种蛋白质的相对含量差别很大,其中所有蛋白质种类等电点和各自所对应的分子量之间存在显著的相关性。相对国内外相关报道,本研究首次应用双向电泳技术获得木麻黄花粉高分辨率的蛋白质图谱,并通过相应软件获得详细的量化信息。本研究结果将为今后进一步确定木麻黄花粉变应原中的致敏蛋白并应用与相关临床研究奠定基础。     

薄壳山核桃蛋白质测定方法比较以及双向电泳体系的建立

本研究以薄壳山核桃生长季方块芽接不同发育时期的嫁接为材料,采用不同的蛋白质抽提方法(TCA-丙酮沉淀法,改良TCA-丙酮沉淀法,Tris-HCL浸提法和酚抽提法)、上样量及IPG胶条p H范围等关键因素进行探索与优化,旨在获得薄壳山核桃蛋白的最佳提取方法,并建立适用、高效的薄壳山核桃蛋白质双向凝胶电泳技术体系。Tris-HCL浸提法进行蛋白质的提取效果最佳,可检测到的蛋白质点数量最多约为1 504个,蛋白质中杂质较少,凝胶背景较清晰,基本无横向和竖向条纹,分离出的蛋白质点基本没有拖尾现象。以p H 4~7的IPG胶条、上样量260μg进行双向电泳,蛋白点数量多,分离效果好,基本没有重叠现象,效果最佳。     

不同国产酿造大麦蛋白质双向电泳差异性分析

应用双向电泳技术对不同品种的国产酿造大麦的蛋白质组成进行了差异性分析。电泳图谱显示,所有供试样品的双向电泳图谱中的蛋白质点均达到300个左右,几种供试大麦品种的蛋白质组成基本相同,蛋白质主要分布于等电点7.6~10.0、分子量大于43.0kDa的区域,其数量占总蛋白质数量的20%左右。而蛋白组成的主要差异蛋白质点共有6个,分子量在43~66kDa之间,等电点在6.5左右,基本上找到了不同品种国产酿造大麦蛋白组成的差异。     

水稻籽粒蛋白双向电泳条件的优化及其蛋白组学方法的比较

探讨适用于籽粒蛋白组学研究的策略,对深入研究籽粒的发育过程具有重要的意义。本文对比了3种不同的蛋白提取方法,优化了双向电泳中自制管胶一向的等电聚焦条件和IPG干胶条一向的等电聚焦时间,以MALDI-TOF/MS、Western-blot和磷酸化蛋白组学3个重要的蛋白质组学研究方法对胶内蛋白质鉴定分析。结果表明,可溶性蛋白提取法最适用于籽粒蛋白组学的研究; 电泳条件优化后,得到了较优的2-DE图谱; 胶内蛋白点适用于质谱分析、蛋白表达量验证(Western-blot)及籽粒蛋白的磷酸化组学的研究。本研究为下一步在蛋白组水平上分析籽粒发育提供了技术支持。     

玉米总蛋白质提取技术和蛋白质样品浓度测定方法的比较

玉米组织蛋白质的提取及其浓度测定是进行玉米蛋白质组学研究的关键步骤。本研究以玉米叶片和花丝为试材,从总蛋白提取数量和质量方面比较分析了磷酸缓冲液法、Tris法、改进Tris法、TCA-acetone(三氯醋酸-丙酮沉淀)法、Plant Total Protein Extraction Kit试剂盒法及其改良法等6种玉米总蛋白质提取方法。同时,又比较分析了Bradford法、2-D Quant Kit试剂盒法和紫外分光光度法(UV法)等3种方法测定蛋白质浓度的准确性。结果表明:(1)总蛋白提取数量按大小顺序为:试剂盒法试剂盒改良法改进Tris法Tris法TCA-acetone法磷酸缓冲液法;(2)总蛋白提取质量依质量优劣为:试剂盒法试剂盒改良法TCA-acetone法改进Tris法Tris法磷酸缓冲液法;(3)Bradford法与2-D Quant Kit法测定的蛋白质浓度均是准确的,且没有显著差异;但是UV法测定的蛋白质浓度欠准确。经综合考虑,改进Tris法用于SDS-PAGE分析,试剂盒改良法用于2-DE分析,Bradford法用于测定蛋白质浓度是经济有效的方法。这对玉米蛋白质组学的研究具有参考价值。     

甜瓜叶片蛋白的提取和双向电泳体系的优化

为建立适合甜瓜(Cucumis melo L.)叶片蛋白质组分析的双向电泳体系(2-D),以甜瓜植物叶片为试验材料,比较了2种不同植物叶片蛋白的提取方法,并对双向电泳的2个重要的环节技术即聚焦参数和上样量进行了优化。结果表明：与Tirs-酚提取法相比,使用改良后的Mg/NP-40/PEG3350/TCA丙酮提取法提取叶片蛋白,经过SDS-PAGEF分析之后,所得的蛋白含量较高,Rubisco酶去除的较好,条带清晰。采用 pH 3~10,18 cm的IPG胶条进行双向电泳时,适当增加低电压聚焦时间,得到了较为清晰的2-D图谱。蛋白上样量为800 μg时,得到的蛋白点数最多,低峰度蛋白较为清晰。研究建立了适用于甜瓜叶片蛋白分析的双向电泳体系,得到了蛋白点数目多且分辨率高的双向电泳图谱。为下一步在蛋白组学水平上分析与甜瓜抗病、产量、性状等相关蛋白提供了技术支持。     

苦瓜种子蛋白质组双向电泳技术条件的优化

通过对苦瓜种子蛋白质样品的提取方法、等电聚焦参数、SDS-PAGE分离胶浓度以及胶条pH范围的优化筛选,建立了适合苦瓜种子蛋白组分析的双向电泳体系.结果表明:使用TCA-丙酮提取方法提取苦瓜种子蛋白,更适用于双向电泳分析,结合使用pH=5~8 IPG胶条以及优化的聚焦程序,能获得分辨率较高、蛋白点清晰、重复性好的2-DE图谱.经银染显色,可检测约660个蛋白点,主要分布在p H=5~8;该体系适合用于分析苦瓜种子的蛋白质组.