棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

[目的]DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用.研究棉花中DELLA基因的功能.[方法]从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型.[结果]序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域.采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47;以上.转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型.[结论]过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育.     

Cloning and Expression Analysis of a Brassinosteroid Biosynthetic Enzyme Gene, GhDWF1, from Cotton （Gossypium hirsuturm L.）

Brassinosteroids （BRs） are an important class of plant steroidal hormones that are essential in a wide variety of physiological processes. To determine the effects of BRs on the development of cotton fibers, through screening cotton fiber EST database and contigging the candidate ESTs, a key gene （GhDWF1） involved in the upstream biosynthetic pathway of BRs was cloned from developing fibers of upland cotton （Gossypium hirsutum L.） cv. Xuzhou 142. The full length of the cloned cDNA is 1 849 bp, including a 37 bp 5＇-untranslated region, an ORF of 1 692 bp, and a 120 bp 3＇-untranslated region. The cDNA encodes a polypeptide of 563 amino acid residues with a predicted molecular mass of 65 kD. The deduced amino acid sequence has high homology with the BR biosynthetic enzyme, DWARF1/DIMINUTO, from rice, maize, pea, tomato, and Arabidopsis. Furthermore, the typical conserved structures, such as the transmembrane domain, the FAD- dependent oxidase domain, and the FAD-binding site, are present in the GhDWF1 protein. The Southern blot indicated that the GhDWF1 gene is a single copy in upland cotton genome. RT-PCR analysis revealed that the highest level of GhDWF1 expression was detected in 0 DPA （day post anthesis） ovule （with fibers） while the lowest level was observed in cotyledon. The GhDWF1 gene presents high expression levels in root, young stem, and fiber, especially, at the fiber developmental stage of secondary cell wall accumulation. Moreover, the expression level was higher in ovules （with fibers） of wildtype （Xuzhou 142） than in ovules of fuzzless-lintless mutant at the same developmental stages （0 and 4 DPA）. The results suggest that the GhDWF1 gene plays a crucial role in fiber development.     

Molecular Identification and Expression Analysis of GhHYDRA 1 Gene,a Homologue of HYDRA1 Gene From Upland Cotton （Gossypium hirsutum L.）

Beside as precursors of BRs biosynthesis,more and more evidences supposed that phytosterols play an important role in plant growth and development.To investigate the effects of phytosterols on the fiber development of upland cotton(Gossypium hirsutum L.)and the molecular base of sterol regulating cotton fiber growth,a homologue of HYDRA1 was cloned from upland cotton(cv.Xuzhou 142)by screening cotton fiber EST database and contigging the candidate ESTs.The GhHYDRA1 encoded a polypeptide of 218 amino acid residues and the deduced amino acid sequences had high homology with the members of HYDRA1 in Populus trichocarpa,Solanum tuberosum,and Arabidopsis thaliana.Moreover,GhHYDRA1 had comparable transmembrane regions to AtHYDRA1 in sequence,length,order,and spacing,except for a C-terminal polylysine cluster.Quantitative real-time RT-PCR analysis revealed that the higher expression levels of GhHYDRA1 gene were detected in 6 to 12 DPA(days post anthesis)fibers,while the lower levels were observed in 0 DPA ovule(with fibers)and 16 to 18 DPA fibers.These results indicated that GhHYDRA1 is the homologue of HYDRA1 gene and plays a crucial role in fiber elongation.Furthermore,auxin and BL up-regulated the expression level of GhHYDRA1 while ABA and KT down-regulated the expression level of GhHYDRA1 in cotton ovule and fiber growth.The result suggested that phytosterols play a role in the interaction of plant hormones.     

棉花油菜素类固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表达分析

 【目的】研究油菜素类固醇物质（BRs）在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合，从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1 849 bp，包含一个1 692 bp的开放阅读框，推导编码563个氨基酸，与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性，具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强，在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比，无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。     

荧光实时定量PCR研究GA负调控因子基因在棉花纤维不同发育时期的表达模式

棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用,采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因Gh RGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究,通过提取来源于不同纤维发育阶段[包括-3~0 DPA(开花后)胚珠,3 DPA胚珠,5 DPA胚珠,10 DPA胚珠,15 DPA纤维,25 DPA纤维]的样品总RNA,探讨不同发育时期Gh RGL基因的表达模式。结果显示,Gh RGL基因在所有被选的样品中都有表达,其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中转录水平较高,在10 DPA胚珠中表达水平最高,在-3~0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维中的表达水平较低,表明Gh RGL基因在纤维伸长期表达水平较高,暗示Gh RGL可能对纤维伸长起着重要作用。     

彩色棉纤维中矿质元素含量与纤维品质形成的关系

【目的】探讨彩色棉纤维中大量元素含量与彩色棉纤维品质形成的关系。【方法】选用棕色棉(X008)、绿色棉(S029)和白色棉(Xuzhou142)为材料,对彩色棉纤维发育过程(开花后20—50d)中大量元素(N,P,K,Ca和Mg)、黄酮色素和纤维素以及纤维品质指标进行分析。【结果】(1)彩色棉纤维细胞中纤维素的含量显著偏低,比白色棉降低15%左右;黄酮色素含量较高,比白色棉纤维高4—10倍;大量元素的含量(除K)明显偏高,比白色棉提高1—2倍;(2)相关性分析结果显示,成熟彩色棉纤维的品质指标与纤维中纤维素含量呈极显著的正相关,与纤维中总黄酮含量呈极显著负相关;棉纤维中大量元素N、P和Ca的含量与纤维素含量呈极显著的负相关,与纤维中黄酮色素含量呈极显著的正相关。【结论】彩色棉纤维中N、P和Ca元素含量的提高可能有利于黄酮色素的合成,而黄酮色素的积累使得彩色棉纤维中纤维素含量降低,这可能是引起彩色棉纤维品质偏差的原因之一。     

cDNA芯片筛选亚洲棉短绒分化发育相关基因

 【目的】筛选亚洲棉短绒分化发育相关基因。【方法】利用cDNA芯片技术在棉纤维发育前期开花前3天(-3DPA)、开花当天(0DPA)、开花后3天(+3DPA)、5天(+5DPA)、7天(+7DPA)筛选野生型DPL971与其短绒突变体DPL972的差异基因。通过与模式植物拟南芥数据库相结合,找到与棉纤维起始发育相关基因,并通过RT-PCR和Real-Time PCR（QRT-PCR）验证部分侯选基因。【结果】筛选出与亚洲棉纤维起始分化发育相关基因8个,其中相对应的与拟南芥同源性较高的蛋白有7个,分别为KAK（DR461366）、MYB5（ES812048）、TTG1（ES811600）、MYB23（DR453866）、CSLD3（DR459646）、RHD2（DR461821）和ZWI（ES791383）,这些基因在拟南芥的表皮毛起始发育过程中都起着重要的作用。RT-PCR和QRT-PCR结果表明MYB23、MYB5、TTG1、CSLD3、RHD2这5个基因在短绒突变体DPL972与其野生型DPL971的+3DPA胚珠中表达差异都有差异。【结论】上述结果表明这5个基因可能与短绒分化发育相关,第1个基因可能抑制短绒分化和发育,后4个则促进短绒分化和发育。     

发育中棉纤维硫酸木质素含量的动态变化

[目的]比较发育中棉纤维硫酸木质素含量的动态变化.[方法]采用硫酸法测定发育中棉纤维木质素含量.[结果]单位棉铃硫酸木质素含量随棉纤维次生壁的增厚呈递增趋势,海岛棉硫酸木质素含量总体低于陆地棉.棉纤维硫酸木质素含量的动态变化呈“S”型曲线,棉纤维硫酸木质素含量变化符合Logistic函数,陆地棉硫酸木质素含量快速累积时期持续的时间长于海岛棉,但单位棉铃硫酸木质素含量最大累积速率出现的时间要晚于海岛棉,而陆地棉单位棉铃硫酸木质素最大累积速率(Vmax)与海岛棉间没有显著差异.[结论]海岛棉与陆地棉相同发育时期内的硫酸木质素含量差异显著.     

棉花胚珠纤维细胞分化的研究——纤维细胞初期发育阶段超微结构观察

以陆地棉北农-1号(BN-1)和光籽突变种(MXZ-142)为材料,超薄切片透射电镜(TEM)连续观察开花前2天至开花后后2天的胚珠表皮细胞超微结构的变化,从解剖学上观察研究胚珠表皮细胞的分化发育。开花前后 BN-1胚珠表皮纤维原始细胞发生一系列显著变化:开花前,表皮细胞中各种细胞器含量较不丰富,没有细胞突起。开花当天纤维原始细胞突起,细胞核增大,线粒体、高尔基体、内质网增多,部分胞间连丝消失。亮、暗两类细胞均可突起成纤维细胞,暗细胞是液泡内酚类物质弥散至胞质所致。MXZ-142胚珠表皮细胞变化相应较小,与BN-1未突起的细胞相似,胞间连丝未见消失,没有表皮毛细胞的分化突起。本文还讨论了棉花胚珠表皮纤维细胞的分化机理。     

海岛棉GH9基因家族成员鉴定及分析

植物GH9基因在细胞壁的生物合成和重塑中起着重要作用,对海岛棉GH9基因进行全基因组鉴定与分析,挖掘其在棉纤维发育中的作用。从海岛棉全基因组中鉴定到53个GH9基因,分析其理化性质、基因结构、染色体分布、进化历程、棉纤维发育过程中表达模式及转录调控。结果表明,53个GbGH9s分为A、B、C三组,定位在22条染色体上;多倍化事件是海岛棉GH9基因家族扩张的主要驱动力,基因复制后经历严格的选择约束;A组多个成员在棉纤维发育整个时期尤其是次生壁加厚期高表达,C组多个成员在棉纤维起始和伸长期优势表达,B组具有相对复杂的表达模式,生长素和乙烯可能在GbGH9s的转录调控中发挥重要作用。此外,通过回交将GbGH9B6导入陆地棉可提高棉纤维强度。海岛棉GH9基因家族成员的鉴定及分析有助于明确其进化和功能,为后续研究提供重要参考。     

棉花纤维蛋白双向电泳体系的建立

[目的]探索一套适合于棉花纤维蛋白的双向电泳技术,为研究棉花纤维发育的蛋白质组学奠定基础.[方法]以陆地棉徐州142为材料,比较了三种不同蛋白质提取方法以及不同裂解液组成对双向电泳的影响,并在蛋白上样量和染色方法等方面进行了探索与优化.[结果]利用饱和酚-甲醇醋酸铵法提取的棉花纤维蛋白,其蛋白含量较高,且SDS-PAGE电泳条带清晰;样品溶解于含有硫脲和CHAPS的裂解液中,其蛋白溶解度增加;不同的蛋白上样量比较结果表明,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(7 cm)的最适上样量为300 μg;同时,经改良后的考马斯亮蓝染-脱色后,2-D图谱的背景清晰,分辨蛋白斑点数增加.[结论]研究建立了一套适用于棉花纤维蛋白总蛋白质组分析的双向电泳方法.     

远缘杂交对彩色棉品种性状影响及品种改良研究

利用远缘杂交结合系统选择方法,以天然棕色棉BC1089、绿色棉GC1011(Gossypium hirsutum L)和白色海岛棉324(Gossypium barbadense L)为亲本配置杂交组合,从F1代开始连续自交,在其分离后代中选育出性状稳定的彩色棉新种质,这些种质材料的纤维品质和产量都比其亲本有所改进,方差分析结果表明,远缘杂交后代稳定株系纤维品质及产量都得到了不同程度的提高。     

棉花2个新的PPR基因的克隆及表达模式分析

【目的】从棉花中克隆2个新的PPR基因,分析其序列结构、基因表达和亚细胞定位,为深入研究这2个基因在棉花中的功能提供依据。【方法】利用棉花EST库,通过RT-PCR从陆地棉徐州142中克隆得到2个PPR基因：GhPPRH1和GhPPRH2;应用生物信息学方法对2个基因编码蛋白序列进行预测分析,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法分析目的基因在不同组织及纤维不同发育时期的表达模式;利用棉花子叶瞬时表达系统对上述2个基因编码的蛋白进行亚细胞定位。【结果】GhPPRH1和GhPPRH2均属于PPR基因家族的PLS亚家族;GhPPRH1和GhPPRH2的开放读码框的长度分别为1 917和2 556 bp,编码638和851个氨基酸;GhPPRH1蛋白有18个PPR基序,包含1个E+结构域和1个DYW结构;GhPPRH2蛋白有17个PPR基序,包含1个E结构域,1个E+结构域和1个DYW结构;将GhPPRH1和GhPPRH2蛋白的氨基酸序列与GenBank数据库中的9条同源蛋白以及棉花中已经报道的5个PPR蛋白的氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示,GhPPRH1与水稻RF1b蛋白亲缘关系较近,推测其可能与胞质雄性不育的育性恢复相关,而GhPPRH2与玉米PPR5蛋白亲缘关系最近,推测可能会影响细胞器一些转录本的RNA编辑;半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的结果表明,GhPPRH1和GhPPRH2在根、茎、叶、花及纤维发育不同时期均有表达,GhPPRH1在根中表达较高,而GhPPRH2在根、叶及15 d的纤维中表达较高;亚细胞定位结果显示,GFP标记的GhPPRH1蛋白的绿色荧光与线粒体Marker的红色荧光重叠,表明该蛋白可能定位于线粒体,GFP标记的GhPPRH2蛋白的绿色荧光与叶绿体自发的红色荧光重叠,表明GhPPRH2可能定位在叶绿体。【结论】从棉花中获得2个新的PPR基因,均属于PLS亚家族成员,亚细胞定位显示可能在线粒体和叶绿体中,推测其功能可能与细胞器中RNA的加工、修饰等过程有关。     

陆地棉中长绒杂种优势的研究

近年来,利用基因生物技术并结合常规育种对植物进行改良的研究,在创造新品种和新材料等领域发挥了重要作用。利用 Ti 质粒的 T—DNA 系统,应用于双子叶植物得到了一些抗虫、抗除草剂的植物。但由于农杆菌难以侵染单子叶植物,使 Ti 质粒系统在禾谷类作物改良上得到很大限制。为此发展了外源基因导入技术,即通过不同途径,把外源基因或 DNA 片段直     

陆地棉中长绒杂种优势的研究

1991年在北京对两个陆地棉中长绒杂交组合、一个一般陆地棉杂交组合和两个陆海杂交组合 F_1的研究表明:陆地棉中长绒杂交种可以把高产和优质有机地结合在一起,其皮棉产量超过陆地棉对照品种中126%和3%,纤维长度、细度和强度仍保持中长绒亲本水平,基本接近陆海杂交种的各项指标。     

新疆棕色棉纤维中原花青素的提取及鉴定

选取新疆5个棕色棉品种(系),分别为棕86、新彩棉1号、新彩棉5号、棕196和棕470,它们的纤维色泽由深到浅依次为棕86>新彩棉5号>棕196>新彩棉1号>棕470。以普通白色棉品种为对照,用含体积分数为0.1%三氟乙酸的乙腈水溶液(乙腈水溶液的体积分数为50%)分别冷浸提取各品种(系)的棉纤维色素,通过紫外光谱吸收和铁盐催化法鉴定出棕色棉和白色棉纤维提取液中均含有原花青素;利用铁盐催化反应比色法定量测定棕色棉和白色棉纤维中原花青素含量。结果显示,棕色棉纤维中原花青素含量明显高于白色棉;除棕470外,棕色棉纤维的色泽同原花青素的含量明显相关,棕色棉纤维的色泽越深,其原花青素的含量越高。可见,原花青素是棕色棉纤维色素的一种重要组分。     

棉花纤维品质改良相关基因研究进展

棉纤维是优良的、使用最为广泛的天然纤维。随着人们生活水平的提高,对天然纯棉织物的需求不断增加,同时对品质的要求也愈来愈高。因此,提高棉纤维产量和品质成为当前棉花遗传育种的重要目标,对棉纤维发育相关基因的克隆与功能研究是实现这一目标的重要基础。棉纤维发育由4个明显但又重叠的时期组成,包括纤维细胞的起始、伸长(初生壁合成)、次生壁合成和脱水成熟。起始是影响纤维细胞数量的重要时期,而纤维长度和强度的决定发生在次生壁合成期和脱水成熟期。棉纤维发育是一个复杂而有序的过程,由大量的基因参与调控。目前,已经有一些在棉纤维发育过程中发挥重要作用的基因被报道,包括各种转录因子、参与激素代谢基因、编码细胞壁蛋白和细胞骨架蛋白基因、活性氧代谢相关基因、以及参与糖和脂类代谢的基因等。文中对已报道的这些与棉花纤维发育相关基因的克隆和功能分析进行了系统总结,以期为棉花纤维发育及品质改良研究提供参考。     

从棉胚珠衍生细胞培养纤维的研究

本研究以棉花 BN-1(栽培种)和 MXZ-142(光籽突变种)为材料,通过对其受精和未受精胚珠的离体培养,明确了:受精 BN-1胚珠培养在 BT 培养基上能长出纤维,GA_3或GA_3和 IAA 能促进纤维伸长。而未受精 BN-1胚珠必需在 GA_3或 GA_3和 IAA 存在时才能长出纤维;MXZ-142胚珠无论受精与否均不能在 BT 培养基上正常生长,但当补充了 GA_3或 GA_3和IAA 后则生长良好;当有 GA_3存在于 BT-培养基中时,MXZ-142胚珠珠柄端和受伤部位均能产生绒状细胞群,它是由高度伸长的细胞组成的,来自受伤部位细胞或经过了愈伤组织阶段。认为这些细胞是早期发育阶段的纤维并具有发育为成熟纤维的能力。