IBV S1基因RT—PCR产物的分子克隆

报道了在两条引物的５‘端加有不同酶切位点的ＩＢＶ Ｄ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物与ｐＵＣ１８进行分子克隆的研究情况。采用自己改进的微量基因克隆的方法，经回收的插入片段的分子量大小及ＨａｅⅢ酶切分析，证明获得了两株重组质粒转化子。     

昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展

杆状病毒表达载体系统是当前基因工程四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。文章对杆状病毒表达载体筛选、用于蛋白生产的昆虫细胞培养的研究现状、存在的问题、解决途径和展望进行了较详细的论述。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因植物表达载体的构建

以含传染性支气管炎病毒（ZJ971毒株）S1基因的质粒PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.7kb左右的S1基因产物；用XbalI和BamHI酶切纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，定向克隆到植物表达载体PBI121中,PCR及酶切鉴定表明，质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中。     

表达鸡传染性支气管病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒M41株的基因序列(GenBank:AY851295.1),设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增其S1基因,并将扩增产物克隆到杆状病毒转移质粒pFast-VSV-G-CMV中,获得重组质粒pFast-VSV-G-CMV-S1,进一步将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-CMV-S1,再利用脂质体转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-V-S1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达S1蛋白.     

中国食肾病变IBV分离株S1基因的RT—PCR／RFLP特性

对中国１３个省市分离到的２９个肾病变ＩＢＶ毒株作了Ｓ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ／ＲＦＬＰ特性鉴定用相同的一对引物,８个毒株－广东０１／８３,河南／０４／９４,河南／０５／９４,内蒙／０１／９３,江苏／０１／９３,河南／０１／０３、天津／０２／９３,内蒙／０２／９３,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得了包含有Ｓ１基因ｃＤＮＡ的１７３４ｂｐ的片段,河南／０６／９５的为－１０００ｂｐ左右的片段;其它２０个毒株没有结果。经     

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因杆状病毒/昆虫细胞表达系统重组质粒的构建

用限制性内切酶从克隆质粒pUC—s中回收猪传染性胃肠炎病毒中国分离株,TH-98株完整的病毒保护性抗原基因,即S基因。按照预定的阅读框架,将S基因克隆于供体质粒pFASTBACHTb的EcoRI、PstI多克隆位点上,并进行酶切鉴定,得到阳性重组质粒BAC—S。用DH10BAC对BAC—S进行转位,获得重组质粒pBAC—S。根据S基因酶切位点分析结果及杆状病毒(Bac-ulovirus)转位区结构特点,用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定,并用特异性和通用引物进行PCR分析,证明该重组质粒为含有TH-98株完整S基因的可直接在昆虫细胞进行表达的感染性重组质粒。     

呼肠孤病毒3型S1基因在Sf9昆虫细胞中的表达

利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法（IFA）和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白的研究进展

本文对禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）纤突蛋白的形态，结构，免疫学活性，血凝活性，与病毒血清型的关系，尤其是其分子生物学研究的新近进展进行了综述，以期对ＩＢＶ基因工程疫苗的制备及疾病的快速诊断和防治打下基础。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以提纯的IBV-M病毒抗原免疫BALB/C小鼠,末次免疫后三天取脾细胞与SP_2/O细胞在50％PEG2000作用下融合,三次融合两次获得成功。经抗体检测、筛选和克隆化培养,最后获得三株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系。三株杂交癌细胞经体外连续传代培养2个多月,以及液氮冻存4个月后复苏培养,仍能稳定地分泌抗体。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒(IBV)的分离和某些生物学特性研究

用鸡胚传代方法从肾脏肿大的病死雏鸡分离到了两株鸡肾型传染性支气管炎病毒,命名为ＭＫ和ＭＧ,并对其某些生物学特性进行了研究。结果分离的两株病毒在电镜下表现为典型的冠状病毒形态;接种易感雏鸡能引起明显的肾脏病变;含病毒的鸡胚尿囊液经１％胰酶处理后能凝集鸡红细胞,且于接种后７２～９６ｈ的活胚尿囊液血凝价较高;能干扰新城疫在鸡胚中的增殖;鸡胚半数感染量ＭＫ－６为１０７７５／ｍｌ、ＭＧ－６为１０７５／ｍｌ。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株与疫苗株抗原相关性和S1基因序列分析

本实验挑选8株近年来山东省IBV分离株与疫苗株H120和491,利用SPF鸡分别制备了高免阳性血清,进行鸡胚交叉中和试验,计算其抗原相关系数,鉴定其血清型,并结合S1基因序列分析,研究其血清型和基因型之间的关系.结果显示:SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701与疫苗株H120同属Mass血清型的不同亚型,其它5个分离株与H120和491不属于同一个血清型.结合S1基因序列分析发现,S1基因序列分析与血清中和结果二者不具有明显的相关性,8个分离株分属三个基因群,其中SDTA06111与H120等同属一个基因群,但血清中和实验显示它们不属于一个血清型;CK/CH/SD09/005与一个参考株独自构成一个基因群,其S1基因变异程度较大,并且能够与两个疫苗株发生交叉中和实验,但不属于一个血清型,它可能是一个基因重组后病毒.     

IBV S1基因不对称PCR的研究

ＤＮＡ模板为ＩＢＶ广东地方株Ｄ４１经病毒ＲＮＡ提取后反转录而获得；两引物为ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列；跨幅为１．７ｋｂ。当限制性引物（Ｏｌｉｇｏ ３’）终浓度为０．８ｍｇ／Ｌ、两引物比例为１∶１０时，即得到不对称ＰＣＲ的预计单链和双链ＤＮＡ产物。此研究结果及不对称ＰＣＲ反应条件为国内首次报道。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞杂交瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ１、４ＡＦ１、６ＤＨ８及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ８２株单抗特异性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩＳＡ测定，各株单抗４０ｈ培养上清效价达１０－２～１０－４，第７天腹水效价达１０－５～１０－６，４ＡＦ１、６ＤＨ８与所试７个ＩＢＶ标准株及２个ＩＢＶ分离株都发生反应     

鸡传染性支气管炎二价灭活苗的研制

从上海、江苏、大连等地的患病鸡群中分离到８株病毒，经鉴定确认为鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）。从中挑选出２株具代表性毒株（Ｃ９００１、ＤＬＺ９１１１）研制出二价油佐剂灭活苗。结果表明，１∶１００稀释的二价油佐剂灭活苗最小免疫剂量０．５ｍｌ／只，一次免疫对支气管炎型ＩＢ的保护率可达６６．６７％，对肾型ＩＢ的保护率可达８３．３３％。０．２ｍｌ的二价苗免疫１５日龄的雏鸡，１５ｄ后攻毒，对肾型ＩＢ的保护率达１００％，而肾型和支气管炎型单价苗的免疫保护率分别为９０％和８０％。通过实验室的免疫试验和临床应用，证明安全高效。     

鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚肾细胞和气管环培养中的适应性比较

将６株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分别接种鸡胚肾细胞（ＣＥＫＣ）和气管环培养（ＴＯＣ）。６株病毒无论是否已经适应于鸡胚，都在气管环培养中能引起病变。病毒适应于ＣＥＫＣ，是与病毒在鸡胚和细胞培养上的传代次数有关。分别用ＳＰＦ鸡胚、非免疫鸡胚和普通鸡胚制备的ＴＯＣ测定ＩＢＶ－Ｍ４１株的ＩＤ５０，结果用ＳＰＦ鸡胚和非免疫鸡胚制备的ＴＯＣ测定的ＩＤ５０都获得较高滴度，而在普通鸡胚制备的ＴＯＣ中ＩＤ５０明显低。     

禽传染性支气管炎——肾变病型病毒的分离和初步鉴定

从发病雏鸡的肾脏中分离到一株禽传染性支气管炎——肾变病型〔AvianInfectious Bronchitis(IB)——Nephrosis Form〕病毒。经盲传三代接种鸡胚后,出现典型的侏儒胚病变。该病毒能被乙醚、氯仿灭活,经56℃30分钟后被灭活,但能抵抗 pH2 30分钟。在电子显微镜下,病毒粒子直径为103nm,有19nm 宽的囊膜,囊膜上有典型的球状突起呈花冠状。病毒粒子内部有一典型的马蹄型结构