小鼠皮肤成纤维细胞与早期胚胎共生体系的构建

【目的】构建小鼠早期胚胎与皮肤成纤维细胞共生的微环境体系。【方法】分离培养EGFP纯合阳性成年ICR小鼠皮肤成纤维细胞。取激素超排合笼后2.5 d小鼠8-细胞胚胎,通过显微操作系统将4~6个EGFP阳性小鼠皮肤成纤维细胞注射到小鼠早期8-细胞胚胎中,转移发育到囊胚阶段的共生胚胎至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,在小鼠胚胎干细胞分离培养条件下进行培养。【结果】EGFP阳性小鼠成纤维细胞注射到小鼠胚胎后,荧光显微镜下显示,EGFP阳性小鼠成纤维细胞分布到小鼠囊胚组成细胞中,参与小鼠囊胚组成。在发育到囊胚的共生胚胎中,EGFP阳性小鼠成纤维细胞分布到小鼠囊胚细胞中的比例为93.73%(269/287)。在小鼠胚胎干细胞的分离培养条件下,2.60%(7/269)共生胚胎中EGFP阳性小鼠成纤维细胞参与小鼠胚胎内细胞团的组成。【结论】小鼠皮肤成纤维细胞与小鼠早期胚胎能够形成共生的微环境体系。     

利用胚胎染色体分析法验证PCR鉴定小鼠胚胎性别技术的研究

 本实验用小鼠切割胚制备了73枚囊胚和扩展囊胚的染色体性别鉴定标本，将其中26枚胚胎的活组织样品（含5-10个细胞）进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR），以检测Y染色体性别决定区（Sex determining region of the Y,简称SRY）片段的存在，并鉴定胚胎的性别。26个样品中有24个的性别鉴定结果和染色体分析的结果相符，从而证明用PCR鉴定小鼠胚胎性别技术的准确率为92.3%(24/26)。     

分子技术对表达GFP转基因胚胎的再检测

把经脂质体包埋的含CD59基因的重组质粒pEGFP-CD59注进小鼠睾丸组织和小鼠的输精管中,分别过1个月和7d与经过超排处理的母鼠交配,在胚胎发育的不同发育时期冲出胚胎于荧光显微镜下观察,显出荧光的转基因小鼠胚胎经PCR和Southern杂交检测确认,转基因小鼠胚胎阳性率为11%(3/27).表明GFP基因不能完全准确地反映转基因的情况,需要用PCR结合Southern杂交方法对表达绿色荧光蛋白转基因胚胎进行再检测.     

FDA—PI荧光双色法快速检测小鼠桑椹胚活力

本文建立了应用FDA和PI两种荧光物质评价小鼠桑葚胚活力的新方法,此方法简单、可靠。可准确鉴别小鼠桑葚胚活力的强、弱,及胚胎凋亡和死亡。也为客观评价其它动物胚胎活力提供科学依据。     

奶牛结核病皮内变态反应和γ-干扰素法检测对比实验

本研究用双变态反应和γ-干扰素体外释放实验对昆明市某奶牛合作社75头奶牛开展结核病检疫对比实验,单皮试反应(SCT)的检出率为19.0%、双皮试反应(CCT)的检出率13.3%、γ-干扰素实验法(IGRA)的检出率为25.3%。75头牛中SCT、IGRA共同阳性为7头,阳性符合率为36.8%(7/19),阴性符合率91.0%(51/56)。CCT、IGRA两种方法的符合率,75头牛中共同阳性为7头,阳性符合率为36.8%(7/19),阴性符合率94.6%(53/56)。鉴于单纯皮内变态反应诊断的局限性,应进行双侧变态反应,结合γ-干扰素实验法进行检疫。由于γ-干扰素实验法的价格贵,操作要求高,在操作中应严格按照操作要求进行,并进行重复检测。     

拟胚体对成体细胞参与胚胎嵌合的影响

试验尝试构建成体细胞同小鼠早期胚胎的嵌合共生胚胎.取成年人皮肤组织的成纤维细胞,慢病毒转染皮肤成纤维细胞标记EGFP荧光蛋白,同小鼠早期8-细胞胚胎进行嵌合.结果显示慢病毒高效标记人皮肤成纤维细胞表达EGFP荧光蛋白,通过皮肤成纤维细胞与小鼠胚胎干细胞形成的拟胚体环境作用后,皮肤成纤维细胞成功与小鼠胚胎形成嵌合胚,嵌合囊胚形成率为38.08%,表达EGFP荧光蛋白的皮肤成纤维细胞能够嵌合到小鼠胚胎的不同部位.嵌合胚在胚胎干细胞分离培养环境下进行培养,嵌合到小鼠内细胞团的皮肤成纤维细胞参与小鼠内细胞团的组成,参与小鼠内细胞团组成的胚胎占嵌合胚比率为1.74%.小鼠胚胎干细胞拟胚体环境作用可以成功介导人皮肤成纤维细胞同小鼠早期胚胎形成嵌合共生体系.     

应用SPA协同凝集快速诊断猪瘟的研究

本试验用抗猪瘟血清标记金黄色葡萄球菌№1800株制成 SPA-IgG 诊断液,采用玻片协同凝集或微量协同凝集试验用于猪瘟诊断。SPA-IgG 液仅与猪瘟病猪脾淋悬液呈阳性反应,而与健猪及其它非猪瘟猪组织液均呈阴性反应。对55份疑似病猪用 SPA 法和荧光抗体法对比,阳性符合率达95%,阴性符合率为91. 6%。该方法设备简单、方法简便,便于基层应用。     

小鼠胚胎电转外源物质条件的优化

旨在优化电转外源物质进入小鼠胚胎的条件,为电转CRISPR/Cas9系统进入小鼠胚胎进行基因编辑奠定基础。在不同的电转条件下分别将四甲基罗丹明标记的葡聚糖(Tetramethylrhodamine-labelled dextran)、带绿色荧光蛋白标记的质粒pLL3.7和体外转录的绿色荧光蛋白mRNA导入小鼠胚胎细胞,并进行培养,在荧光显微镜下观察胚胎发育状态,分析荧光染料进入胚胎及绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,高电压使胚胎成活率显著下降,低电压使电转效率显著下降。最适电压是110V,且小鼠胚胎2细胞期较1细胞期更适合电转。     

动物布鲁氏菌病不同初筛及确诊方法组合检测差异性比对分析

为探讨布鲁氏菌病采用先初筛、后确诊不同方法及试剂组合检测结果的差异性，对实验室保存的133份牛、羊血清，以英国布病参考实验室RBT、SAT、APHA-cELISA方法为标准确定布病阳性血清73份、阴性血清60份。选择4种初筛方法共6种试剂、2种确诊方法共3种试剂，按照先初筛，对结果阳性样品再确诊的检测程序对确定的133份血清样品分别用6种方法(9种试剂)进行检测，结果表明：用18种组合方法检测牛阳性血清样品，符合率100%的有3种，检测结果假阴性率为0～53.33%;用12种组合方法检测羊阳性血清样品，符合率100%的有2种组合方法，检测结果假阴性率为0～50.00%。用所有方法检测牛阴性血清样品，符合率100%的有1种方法(试剂),检测结果假阳性率为0～77.78%;检测羊阴性血清样品，符合率100%的有4种方法(试剂),检测结果假阳性率为0～41.67%。应用不同的初筛、确诊组合方法检测同批样品，结果出现了多样性。建议布病初筛可优先选择iELISA、RBT、FPA,确诊可优先选择cELISA。     

蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立和比较研究

 为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为40%;对58份已知阳性血清样品同时进行中和实验和C-ELISA检测,检测结果经SPSS软件进行t检测统计分析,Sig.（双侧）=0.651,相关性0.912,相关性显著。对24个BTV血清型阳性血清,2份牛BVD阳性血清,2份羊口蹄疫阳性血清,2份羊痘阳性血清进行检测。结果表明,24个BTV血清型阳性血清为阳性,其他血清全部为阴性。对150份已知阴性血清和55份已知阳性血清用中和试验、美国VMRD 公司试剂盒和本方法分别进行检测。结果表明,本检测方法与中和试验检测结果符合率达100%,进口试剂盒符合率为96.7%。     

Identification of the Sex of Earlier Embryos from Generic Hybrids of Chicken-Quail by Wpkci

In this study, a protocol was developed to identify the sex of earlier embryos of chicken （♂）-quail （♀） hybrids and successfully tested the sex proportion of each period （66-120 h）. We acquired cross bred eggs by artificial insemination, hatched them in the same batch according to the standard hatching condition of chicken, and collected earlier living embryos at 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, and 120 h randomly. We adopted RT-PCR protocol and multiple PCR, made the known sex quail as the external control, employed fl-actin as the internal control, and used primers that were designed according to conservative area of gene Wpkci of quail to identify the sex of earlier hybrid embryos. The results indicated that the primer of Wpkci can be used to identify the sex of hybrid embryos accurately; there were more male than female in earlier embryos, the sex proportion of earlier embryos compared with academic numerical value was significantly different （P〈0.01）, and there was no difference between different periods （P〉0.05）. In the present study, we concluded that a simple, fast, credible and stable protocol to identify the sex of earlier hybrids embryos had been established by using primer of Wpkci; in earlier embryos, the death rate of female was higher than that of male and there was no fluctuant peak.     

应用巢式及复合PCR对小鼠早期胚胎进行性别鉴定

根据小鼠SRY基因，设计并合成内外两对巢式PCR引物；同时。根据ZFY—ZFX基因的同源性，设计合成其共同的巢式PCR引物，对昆白小鼠组织DNA样品进行了性别鉴定。雄性样品可扩增262bp的SRY基因和137bp的ZFY—ZFX基因片断，而雌性样品只能扩增137bp的ZFY-ZFX基因片断，其鉴定结果与已知性别一致。将2-细胞、4-细胞、8-细胞和16细胞胚胎视为微量细胞样品进行PCR扩增，通过常规PCR与巢式PCR、复合PCR的比较。确立了巢式及复合PCR的扩增体系。结合核型分析和PCR法共鉴定21枚胚胎，其中雄性12枚，雌性8枚，鉴定准确率为95．2％。     

应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究

通过设计特异性引物，优化Mg^2＋浓度、退火温度和循环时间等影响PCR的因素，确定了适合现场应用的PCR反应体系；46枚胚胎现场的鉴定率为87％，移植妊娠率为28％，准确率为85％，证明建立的PCR胚胎性别鉴定方法可用于生产。使用LAMP法对126枚常规胚胎和42枚性控胚胎现场鉴定，鉴定率95％，移植妊娠率33％，准确率88％，结果证明该方法可应用于牛早期胚胎性别鉴定。PCR法和LAMP法所鉴定同一样品的结果一致，说明在控制好实验条件的情况下，根据实际情况可选用这两种方法中的任何一种进行性别鉴定应用。     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎bcl-2、P53基因表达的差异及发育性变化

 【目的】探讨细胞凋亡因子bcl-2、P53对鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎发育的影响。【方法】人工授精获得鸡（♂）与鹌鹑（♀）杂交种蛋,按照鸡标准孵化条件同批入孵,随机采集66、72、78、84、90、96、102、108、114、120 h活胚。采用RT-PCR方法,用Wpkci和β-actin引物进行多重PCR鉴定胚胎样本性别,后选取各时间点雌、雄胚胎各4枚,以β-actin为内标,测定bcl-2、P53的mRNA相对丰度。【结果】（1）雄性胚胎66～114 h bcl-2 mRNA表达维持在较低水平,96 h 有所降低,随后回升到原水平,120 h 极显著升高（P＜0.01）,达到峰值;雌性胚胎66～114 h bcl-2 mRNA表达维持在较低水平,114 h 极显著升高（P＜0.01）,此后维持在较高水平,120 h 达到峰值。不同日龄之间的比较,114 h雌性表达显著高于雄性（P＜0.05）;（2）雌、雄胚胎P53 mRNA发育性表达模式基本一致。66 h表达水平较高,72 h表达降低,达到低谷,雄性达到显著（P＜0.05）,雌性整体差异不显著,随后上升维持在原水平;不同日龄之间表达差异不显著。【结论】114 h雌性胚胎bcl-2 mRNA表达高峰点与其P53 bcl-2表达最低水平相吻合;72 h雌、雄胚胎 P53 mRNA表达与P53 bcl-2表达水平一致,处于低谷点;72、114 h早期杂交胚胎bcl-2、P53基因表达出现异常。     

Wpkci基因用于鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎性别鉴定

 【目的】建立鉴定鸡（♂）与鹌鹑（♀）属间杂交早期胚胎性别的方法,检验早期胚胎性别比。【方法】人工授精获得鸡与鹌鹑杂交种蛋,按照鸡的标准孵化条件同批入孵,连续随机采集发育早期66、72、78、84、90、96、102、108、114、120 h活胚。采用RT-PCR方法,以已知性别的鹌鹑作外参照,β-actin引物作内参照,用鹌鹑Wpkci基因保守区设计的引物鉴定早期胚胎样本性别。【结果】Wpkci引物可以准确鉴定杂交胚胎的性别;早期胚胎性比率与理论值相比,差异极显著（P＜0.01）,雄性明显多于雌性;不同天数间性别比率差异不显著（P＞0.05）。【结论】利用Wpkci引物建立了一种简单、快速、可靠、稳定的鉴别杂交胚胎性别的方法;早期胚胎雌性死亡率明显高于雄性,雌性死亡率无特定高峰,需进一步研究。     

应用巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别

为获得一种高效的牛胚胎性别鉴定方法,采用高特异性和灵敏度的巢式PCR进行扩增。结果表明:公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255bp的β-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255bp的β-珠蛋白基因片段。巢式PCR只需3～8个细胞就可以观察到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以牛胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。     

应用牙釉质基因鉴定绒山羊早期胚胎的性别

采用酚-氯仿法和煮沸法从南疆绒山羊血液和早期胚胎中提取基因组DNA,分别以雄羊和雌羊的血液基因组DNA和早期胚胎基因组DNA(约20～30胚胎细胞)为模板,以AMEL引物进行PCR扩增和电泳分析.结果表明:绒山羊5ng量和10pg量血液基因组DNA经扩增后雌性只得到1条非特异性带,雄性得到1条非特异性带和1条特异性带;超微量血液基因组DNA样本(10pg)经巢式扩增和电泳分析能够鉴定绒山羊性别;32枚绒山羊胚胎鉴定结果,雄雌性别比17/15;移植胚胎产羔雄雌比15/14.采用牙釉质基因(AMEL),经巢式扩增和电泳分析能够鉴定绒山羊性别,并对胚胎无损伤;南疆绒山羊早期胚胎性别鉴定结果与胚胎移植后产羔性别结果对比,雌雄性别比率差异不显著(P>0.05).