苎麻SSR反应体系的优化

[目的]优化苎麻SSR反应体系。[方法]以苎麻湘苎2号基因组DNA为模板,对其SSR反应体系中的部分影响因素进行探讨分析,并利用选定的7个苎麻品种基因组DNA为模板,对优化的SSR反应体系进行试验验证。[结果]在25μl SSR反应体系中,模板量为50 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.10 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U时,反应体系为最佳。利用该反应体系,对7个苎麻品种进行的SSR反应结果显示不同品种间DNA谱带多态性丰富,同时表明优化的反应体系重复性和稳定性良好。[结论]该研究结果为应用SSR技术进行苎麻种质资源的研究奠定良好的基础。     

果梅SSR反应体系的优化

以果梅品种小叶猪肝为试材 ,研究了果梅SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响 ,并比较了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明 :在PCR反应体系中 ,Mg2 + 的最适浓度范围为1 89～ 2 83mmol·L-1;dNTP最适浓度为 0 2 4mmol·L-1;引物的最适浓度为 0 38μmol·L-1;Taq 聚合酶在 2 6 5 μL反应体系中宜加入 1U。利用此反应体系 ,对 2 4个果梅代表品种进行了SSR反应 ,用 8%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测 ,扩增产物在 10 0～ 2 0 0bp之间 ,不同品种间DNA谱带多态性丰富。琼脂糖电泳检测的DNA多态性不如聚丙稀酰胺凝胶丰富     

贵州李SSR反应体系的优化

为了得到贵州李SSR扩增最优化反应体系,以贵州李品种早酥为试材,采用单因素试验的方法,对SSR反应体系的主要成分及退火温度进行优化。结果表明:在25μL反应体系中,模板DNA用量为30ng,引物浓度为0.80μmol/L,Master Mix用量为12.5μL;退火温度在46～50℃均能得到清晰的条带。利用此反应体系对16个贵州李品种进行PCR扩增及电泳检测,扩增结果清晰且不同品种间的DNA谱带多态性丰富。表明,该体系适合贵州李的亲缘关系分析。     

椰子SSR反应体系的建立和优化

为摸索适宜椰子的SSR反应体系,分析了PCR反应体系中的Mg2 浓度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度以及退火温度对扩增结果的影响,建立了适合椰子的SSR反应体系。研究结果表明:在20μL反应体系中,Mg2 、引物和dNTP的最适浓度分别为2.5 mmol/L、0.3μmol/L、0.2 mmol/L;TaqDNA聚合酶的最佳使用量为1 U,模板DNA应加入50 ng,引物最佳退火温度比Tm值较小者低2~3℃。在参数优化的基础上,应用标记分析该反应体系对24个海南不同地区高种椰子样品进行SSR分析,不同样品间DNA谱带多态性丰富,本研究建立的分析体系将为今后椰子资源的SSR分析奠定良好的研究基础。     

梨SSR反应体系的优化

为了丰富梨分子遗传图谱的SSR标记,以鸭梨、京白梨及鸭梨×京白梨的实生后代为试材,对影响梨SSR技术PCR反应体系中的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量以及每对引物的退火温度进行了探索,确立了适宜梨的SSR反应体系,即在20 μL反应体系中, 模板DNA用量为30 ng,Mg2+、dNTP和引物的最适浓度分别为1.2 mmol/L、0.15 mmol/L、0.8 μmol/L.Taq DNA聚合酶的最适用量是1.0 U.最后利用该反应体系筛选出了19个适宜梨遗传分析的SSR引物,引物的最佳退火温度为49～55℃,通过8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,表明该反应体系扩增的多态性条带清晰稳定可靠.     

啤酒大麦SSR分子标记PCR反应体系的建立与优化

为建立及优化啤酒大麦SSR分子标记PCR反应体系,以35个啤酒大麦品种(系)为试验材料,利用L16(44)正交试验设计研究DNA、Taq酶、dNTPs及引物浓度对啤酒大麦SSR扩增效果的影响。结果表明:模板DNA 2.0ng、10×PCR buffer 1.0μL、dNTPs 0.6μL、引物(0.25mmol·L-1)1.5μL、Taq酶(2.5U·μL-1)0.45μL的扩增效果最优,扩增结果重复性好且稳定。     

香蕉SSR反应体系的优化

以香蕉品种AAcv Rose为试材,研究了香蕉SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明:在20μL的反应体系中,各成分的最适用量分别为TaqDNA酶0.5U/mL;Mg2 2.5mmol/L;引物0.4μmol/L;模板DNA20～40ng/μL;dNTPs0.1mmol/L。利用24个香蕉品种验证此反应体系,80g/L的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在150～300bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性。聚丙稀酰胺凝胶电泳检测的DNA多态性高于琼脂糖。     

马铃薯SSR标记多重PCR反应体系优化研究

以马铃薯品种克新18为试验材料,探讨了多重PCR反应体系主要成分、引物不同比例关系及退火温度对SSR标记扩增的影响。在不改变其他成分浓度的条件下,对PCR反应体系的4个组分(Taq酶、MgCl2、模板DNA、dNTPs)进行浓度或用量梯度试验;利用正交设计L(934)对反应体系的4对引物组合(STM0014、Pat、SSI、UGP)在3个水平上进行优化;最终确立了马铃薯SSR标记多重PCR反应优化体系,总体积为20μL;2.5μL 25 mmol.L-1 MgCl2,0.6μL 10 mmol.L-1 dNTPs,Taq酶0.8 U,模板DNA 80 ng;4 mmol.L-1的4对引物之间的用量比为2:1:2:3,退火温度为54.7℃。优化后的反应体系重复性好,扩增结果稳定可靠,能够明显区分不同的马铃薯品种。为进一步探讨马铃薯品种资源遗传多样性、构建DNA指纹图谱打下了坚实的基础。     

稻瘟病菌SSR反应体系的优化

稻瘟病菌SSR检测是分子标记辅助育种的一项重要技术。为优化SSR反应体系,以稻瘟病菌菌株504为供试材料,采用单因素筛选法及L9(34)正交试验设计,研究了稻瘟病菌SSR分析中PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响。结果表明:在总体积为20μl的PCR反应中,TaqDNA聚合酶的最适用量为1.0U;Mg~(2 )、dNTP和引物的最适终浓度分别为1.0mmol/L、100μmol/L和0.4μmol/L。利用该体系进行扩增,所得谱带清晰、稳定、非特异性带少。     

桃SSR反应体系的优化

以‘新大久保’桃为试材,利用正交设计直观分析法和2因素完全随机试验优化了桃SSR技术中PCR反应体系.试验结果表明,适宜桃遗传分析的SSR技术体系为：在25 μL反应体系中Taq DNA聚合酶和DNA最适用量分别为1 U和50～100 ng;Mg^2＋ 、dNTP和引物最适终浓度分别为1.5～2.0 mmol/L、0.20～0.28 mmol/L和0.2～0.6 μmol/L.利用30个桃品种验证此反应体系,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在100～300 bp,多态性高,且反应体系的稳定性和可重复性好.     

月季SSR反应体系的优化

以月季品种'月月粉'为试材,利用CTAB法提取DNA,对影响SSR-PCR扩增体系的主要因子设计了多梯度的优化实验,建立了适用于月季的SSR反应体系:总反应体积为25μL,包括模板DNA溶液(20 ng/μL)2μL,10×PCR buffer(Mg2+free)2.5μL,MgCl2(25 mmol/L)2.0μL,dNTPs(10mM)0.5μL,正反引物各(10μmol/L)1μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL.利用该优化体系对部分月季品种进行PCR扩增和电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合用于分析月季的遗传多样性.     

番茄微卫星标记(SSR)反应体系的优化研究

利用番茄材料研究了番茄SSR技术中PCR体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了采用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明:番茄SSR的反应程序为94℃预变性2min;94℃变性30s,50℃复性30s,68℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸8min为佳。反应体系中,模板DNA的适宜浓度为20～40ng,适宜的引物浓度为0.4μmol·L-1,dNTP的适宜浓度为200μmol·L-1,Mg2+的最适浓度范围为2.0mmol·L-1,Taq聚合酶在15μL反应体系中宜加入0.65U。PCR产物检测时聚丙烯酰胺凝胶的分辨率显著高于琼脂糖电泳。     

树莓SSR体系的建立及优化

为建立适宜树莓(Rubus idaeus L.)的SSR分析体系,设计Taq DNA聚合酶、Primer、Mg2+、dNTP和DNA的5因素4水平正交试验,对SSR反应体系进行筛选和优化.结果表明:适宜树莓的SSR分析体系为15μL反应体系中含Taq DNA聚合酶0.5U.Primer 0.21μmol·L-1,Mg2+0.9mmol·L-1,dNTP 0.25 mmol·L-1,DNA 60ng;Primer Rubus285a的最佳退火温度为54～59℃.利用此反应体系对部分树莓品种进行SSR-PCR扩增并电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,证明此体系稳定可靠.     

山核桃SSR反应体系优化

优化SSR反应体系是山核桃SSR遗传图谱构建的基础.通过对PCR反应中Taq聚合酶用量、dNTP浓度、引物浓度、Mg2 浓度和模板DNA量的组合试验,确定了山核桃SSR的最佳反应体系,即在30μL反应体系中,含600 ng模板DNA,1×PCR Buffer,2.0UTaq聚合酶,0.22mmol/L dNTP,1.0 mmol/L Mg2 ,0.13μmol/L引物.     

扁桃SSR反应体系的优化

以南疆部分扁桃品种为试材,利用CTAB法提取基因组DNA,将PCR的主要成分设定4个梯度,优化了扁桃SSR技术中PCR反应体系,试验结果表明,适宜扁桃SSR技术体系为:在20μL反应体系中TaqDNA聚合酶和DNA最适用量分别为1U和100 ng;Mg2 、dNTP和引物最适终浓度分别为1.5 mmol/L、0.20 mmol/L和0.2μmol/L。利用18个扁桃品种验证此反应体系,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物大多在100~300 bp,多态性高,且反应体系的稳定性和可重复性好。     

正交设计优化烟草SSR反应体系

以烤烟品种K326为材料,探讨影响烟草SSR扩增的各种因素,建立能够稳定扩增烟草基因组的体系,为研究烟草重要性状的遗传基础及建立分子辅助标记育种的技术平台奠定基础.结果表明:在总体积为20 μl的PCR反应中,含35 ng模板DNA,1.5U聚合酶.MgCl2终浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为200 μmolVL,引物浓度为0.05 μmol/L时效果较好.     

巴西橡胶树SSR反应体系的优化

以巴西橡胶树无性系针选2号为试验材料,对橡胶树SSR-PCR反应的5个主要因素:TaqDNA聚合酶、Mg2 、引物、DNA模板及dNTPs进行优化试验。筛选出了各反应因素的最佳水平,建立了橡胶树SSR-PCR最佳反应体系(20μl):TaqDNA聚合酶0.8U;Mg2 浓度为1.5mmol/L;引物浓度0.5μmol/L;模板DNA含量50ng;dNTPs浓度0.25mmol/L。并利用此反应体系,用引物1对14个巴西橡胶树品种进行SSR分析,8%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测显示不同品种间DNA谱带多态性丰富。结果证明,此反应体系是稳定可靠的。这为下一步进行的遗传多样性分析、指纹图谱构建等研究奠定基础。     

柑橘苗期SSR鉴定分析体系的优化及初步应用

本文以柑橘幼苗微量叶片(3～5 mg)为材料,改进柑橘基因组DNA提取方法,并对3种PAGE凝胶浓度和3种银染色方法进行了筛选和优化,建立了一种经济,高效的柑橘苗期SSR分析体系.试验结果表明:该微量叶片提取方法需材少,用时短,所提取基因组DNA质量好、纯度高,完全适用于SSR-PCR扩增反应.9%的PAGE凝胶浓度最适合柑橘SSR标记的电泳检测,扩增出的条带清晰,分散良好.改进的两种快速银染方法相对于传统的染色方法染色效果较好,且更加经济.初步对两个柑橘杂交幼苗群体进行了遗传鉴定和分析,2对引物从24株沙田柚与强德勒柚杂交幼苗中鉴定出17株杂种,4对引物在沙田柚与红江橙杂交群体中扩增出14条多态性条带,占总条带数的70.0%.表明所建立的SSR优化体系可为柑橘分子辅助育种提供技术参考.