镉对大鼠原代肝细胞的毒性损伤

用两步灌流法获得大鼠肝细胞,肝细胞暴露于浓度为2.5、5、10μmol/L的醋酸镉24 h.测定了细胞活力、培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性及细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量的变化.结果表明,细胞相对存活率显著下降(P<0.01),LDH、AST和ALT的释放量增加,5μmol/L和10 μmol/L剂量组与对照组相比差异均显著(P<0.01),细胞内GSH-PX活性降低,各剂量染毒组与对照组相比,差异均极显著(P<0.01);细胞内GSH含量升高,5 μmol/L和10μmol/L剂量组与对照组差异均显著(P<0.05),细胞内MDA含量升高,10μmol/L剂量组与对照组相比差异显著(P<0.05).表明镉可致肝细胞损伤,并且氧化应激起了重要作用.     

镉对体外培养大鼠肝细胞DNA甲基化的影响

选用体外培养原代大鼠肝细胞为模型,用醋酸镉进行处理,用免疫荧光法检测了基因组DNA甲基化水平,用偏重亚硫酸氢盐测序法检测了MT、p53和Line1基因的DNA甲基化水平,用qRT-PCR检测了DNMTs基因的mRNA水平。结果显示,原代大鼠肝细胞在体外培养过程中基因组DNA甲基化水平具有缓慢下降的趋势,镉处理加速了这种下降的趋势;但p53、MT和Line1基因的DNA甲基化均未受镉的影响;维持DNA甲基化稳定的DNMTs表达水平受镉的影响呈现下降的趋势。表明镉对肝细胞的损害作用可能是通过降低DNMTs的表达水平,进而破坏基因组DNA甲基化的稳定来完成的;而镉对MT表达水平的影响似乎并非通过DNA甲基化途径来完成,因为在镉处理之前MT的DNA甲基化就已经处在较低的水平。     

镉对体外培养大鼠肝细胞自噬的影响

选用体外培养原代大鼠肝细胞为模型,醋酸镉处理之后,用Westernblot和免疫荧光法检测了自噬标记分子LC3的表达水平,在此基础上,利用自噬激活剂（雷帕霉素）诱导自噬水平的升高,用MTT法分析了镉对细胞存活率的影响。结果显示,原代大鼠肝细胞在体外培养过程中自噬水平具有缓慢上升的趋势,而镉处理延缓了这种趋势,降低了自噬的水平和细胞存活率;利用激活剂增强自噬后不能减弱镉的损伤,表明镉有可能通过抑制自噬的保护作用,造成对肝细胞的损伤。     

乐果对大鼠原代培养肝细胞的毒性试验

通过给大鼠肝细胞培养液中加入乐果(染毒终浓度分别为0,3,30和300μmol/L)染毒,MTT法测定乐果对肝细胞增殖的影响,同时测定肝细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)及细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量,研究了乐果对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用。结果显示,与对照组相比,乐果对原代培养肝细胞增殖有明显的抑制作用,且呈剂量-时间效应关系。染毒后48 h细胞生长达高峰时,细胞活率分别为对照组的97%、82%和75%;300μmol/L染毒组细胞染毒后24 h、36 h、48 h、60 h和72 h细胞活率分别为对照组的67%、82%、75%、71%和63%。同时,乐果染毒12 h和24 h后各染毒组培养液上清中LDH含量均极显著升高(P<0.01),尤其是300μmol/L染毒组12 h和24 h培养液上清中LDH含量分别为对照组的7.35倍和8.75倍;同一剂量组随着染毒时间延长,LDH含量呈上升趋势。染毒12 h和24 h后30μmol/L及300μmol/L组细胞内GSH含量均存在极显著差异(P<0.01);同一剂量组随着染毒时间延长,GSH含量呈下降趋势。表明乐果对肝细胞有直接的毒性作用,能够抑制其增殖,引起细胞膜脂质过氧化损伤。     

原代牛肝细胞分离和培养方法的建立

采用胶原酶灌注消化法,对来自新生小牛血清制备厂的牛肝脏尾状突材料进行肝细胞分离,用台盼蓝拒染法测定总细胞数和肝细胞即时存活率,以每孔1×106个肝细胞的量接种于牛尾胶原包被的6孔细胞培养板,进行单层培养细胞形态学观察和培养基上清液LDH活性测定.结果显示,每头小牛肝脏尾状突分离获得的细胞产量为(3.558±0.096)×108个,肝细胞即时存活率为(84.46±3.56)%,培养24～72 h的肝细胞生长状态最好,适合用于有关肝细胞代谢、中毒、基因表达的研究.     

对乙酰氨基酚对大鼠原代肝细胞的影响

对乙酰氨基酚(AP)是临床常用的解热镇痛药,治疗剂量时对肝脏无影响,过量则导致肝损伤[1-3].目前,许多学者以活体动物为研究对象,通过血清及肝组织匀浆中肝功能的变化,来揭示肝损伤的机制.但实验动物存在个体差异,使肝损伤机制的研究受到局限.体外培养的大鼠原代肝细胞保留着活体内的大部分功能,而且不存在个体差异,在肝损伤机制和筛选保肝药物的研究中越来越得到广泛应用.     

大鼠原代肝细胞的分离与培养

体外培养的大鼠原代肝细胞是研究药物代谢的有效手段,亦是细胞生物学和分子生物学的必需技术。常用的肝细胞分离方法有机械法和酶法。采用何种方法能够获取产率高、活性好、功能强的肝细胞,对于进一步的试验研究十分必要。随着科技的发展,肝细胞分离和培养技术在不断改进。在前     

钙离子超载在镉致大鼠肝细胞凋亡中的作用

拟探讨Ca2+超载在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的作用。采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24 h培养,用醋酸镉、醋酸镉与Bapta-AM共同处理肝细胞。用MTT法检测细胞存活率,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态和凋亡,流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度、ROS生成和ΔΨm变化。结果表明,随着镉剂量的增加和作用时间的延长,细胞变形,坏死细胞和凋亡细胞增多,镉可极显著提高细胞内Ca2+浓度和ROS生成量(P<0.01),极显著降低线粒体膜电位(P<0.01),Bapta-AM可显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低镉的毒性。研究结果提示Ca2+超载在镉致肝细胞凋亡中发挥重要作用。     

镉对大鼠肝细胞基因甲基化的影响

采用已建立的镉损伤肝细胞体外模型（4 μmol/L醋酸镉处理3 h）,通过偏重亚硫酸氢盐测序法和结合偏重亚硫酸氢盐的限制性酶切分析,研究镉对p53、MT和LINE1基因DNA甲基化的影响.结果显示,p53、MT和LINE1基因DNA甲基化均未受镉的影响.     

镉致大鼠肝细胞凋亡及N-乙酰半胱氨酸的保护作用

用两步灌流法获得大鼠肝细胞,应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法、Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞仪检测醋酸镉对肝细胞存活率和凋亡率的影响,以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)的保护效应.结果表明,肝细胞暴露于浓度为2.5、5、10μmol/L的醋酸镉后,细胞相对存活率显著下降(P<0.01),凋亡率显著升高(P<0.05),且具有剂量-效应关系;2 mmol/L的NAC可使细胞相对存活率明显提高(P<0.01),凋亡率下降.结果提示,一定浓度醋酸镉可引起肝细胞凋亡,NAC具有一定的保护作用.     

大鼠原代肝脏细胞的分离培养及其膜受体鉴定

本研究采用改良的两步胶原酶灌流法分离培养大鼠肝脏细胞,并对其进行了形态学观察、功能检测及表面受体的鉴定,以探索其短期培养的最佳功能状态。结果表明,平均每只大鼠可获取2.12×10⁸个肝脏细胞,平均活率达94.23%;光镜下观察发现肝脏细胞呈多角形并成片生长;对肝脏细胞的LDH、Alb和尿素进行连续检测,结果发现细胞离体培养第3天功能较好;Mab263-PE单抗鉴定结果显示,肝脏细胞生长激素受体功能健全尚未受损,为细胞信号转导等相关试验奠定了基础。     

蛹虫草多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用研究

蛹虫草是一种药用真菌。从人工培养的蛹虫草中提取蛹虫草多糖(CMPS),采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,研究蛹虫草多糖对CCl4诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用。结果表明:蛹虫草的子实体和基质都含有丰富的多糖,其中基质中的多糖含量最高,约为子实体的2～4倍;CMPS可明显降低由CCl4诱导的损伤肝细胞培养上清液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的活性水平和丙二醛(MDA)的含量水平,显著提高由CCl4诱导的损伤肝细胞培养上清液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和诱导损伤肝细胞的存活率。试验结果提示CMPS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、瘦素(LEP)在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR ( real time fluorescent quantitative PCR)法观察了神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In的升高，GLNR mRNA表达逐渐增加（P<0.01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNR mRNA表达逐渐降低（P<0.01）；而随着培养液中LEP浓度的升高，GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（P<0.01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP直接调控奶牛肝脏GLNR mRNA的表达。     

新生Wistar大鼠海马神经细胞的体外培养与鉴定

为探讨原代Wistar大鼠海马神经细胞的体外培养方法,本研究取新生24 h内的Wistar大鼠海马组织,无菌剪碎后采用胰酶消化法分离细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,逐日在倒置相差显微镜下观察。结果发现,从海马组织中分离出的神经细胞具有增殖能力,细胞对数生长期为2~8 d,最长培养30 d;细胞经免疫荧光鉴定Nestin表达呈阳性;免疫组织化学结果显示,在传代培养细胞的胞体和突起均有NF阳性标记物,GFAP抗体和CD68抗体显色均为阴性。由此可见,分离培养的细胞是具有自我更新增殖和多分化潜能的神经元细胞。     

AICAR和二甲双胍对产蛋鸡肝细胞AMPK活性及脂质代谢的影响

以产蛋鸡肝细胞为材料，研究添加腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）激活剂AICAR和治疗二型糖尿病药物——二甲双胍对产蛋鸡肝细胞AMPK、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和细胞脂质代谢的影响。试验分4个处理：基础培养液组（对照组）、基础培养液组中分别加入0．5mmol／L AICAR、0．5mmol／L二甲双胍、1mmol／L二甲双胍。结果表明，肝细胞培养100min时，AICAR和二甲双胍均可激活AMPK（P〈0．05），且二甲双胍激活AMPK具有一定的浓度依赖性；AICAR和二甲双胍均可不同程度抑制脂肪酸和胆固醇合成的关键酶ACC和HMGR的活性，AMPK活性与HMGR、ACC活性呈一定的负相关；添加AICAR和二甲双胍抑制产蛋鸡肝细胞甘油三酯和胆固醇合成，AMPK活性与肝细胞甘油三酯和总胆固醇含量也呈一定的负相关。因此，可通过调控产蛋鸡肝脏AMPK活性变化从而调节产蛋鸡脂肪和胆固醇的合成。     

Fas对镉暴露致大鼠大脑皮质自噬体形成的影响

为探究死亡受体Fas在镉暴露致大鼠大脑皮质自噬体形成中的作用,将24只21日龄雄性SD大鼠随机分为4组,分别为对照组、镉组、镉与对照病毒共处理组、镉与Fas基因沉默病毒共处理组。试验期间,对照组大鼠自由饮用纯净水,病毒处理组大鼠于第1天以每只1.4×10¹¹vg的剂量通过尾静脉注射相应病毒,4周后镉染毒组大鼠自由饮用镉水(50 mg·L^-1),持续90 d。试验结束后,透射电镜观察大脑皮质中自噬体数量,Western blot检测大脑皮质细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)、p-Erk1/2、自噬相关蛋白7(ATG7)、自噬相关基因(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达水平,免疫荧光染色检测LC3表达水平。结果显示,镉暴露增加大脑皮质中自噬体数量,极显著激活Erk1/2并上调ATG7、Beclin-1、LC3蛋白表达水平(P<0.01);Fas基因沉默抑制镉引起的自噬体数量增加,极显著抑制镉致Erk1/2激活及ATG7、Beclin-1、LC3蛋白表达水平升高(P<0.01)。结果表明,Fas通过激活Erk1/2参与镉致大鼠大脑皮质自噬体形成。     

柞蚕丝素解酒保肝功能食品对小鼠酒精性肝损伤的防治作用研究

为了探讨柞蚕丝素解酒保肝功能食品对小鼠酒精性肝损伤的防治作用,将90只小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、柞蚕丝素解酒保肝功能食品高、中、低剂量组,连续灌胃30d,测定肝脏MDA、GSH、TG含量,光镜观察肝组织形态学变化。结果显示,与模型组相比,高、中剂量组可明显降低肝匀浆MDA含量,阳性药组和中、低剂量组可明显降低肝匀浆TG含量。阳性药组和高剂量组可明显升高肝匀浆GSH含量升高,表明柞蚕丝素解酒保肝功能食品对小鼠解酒性肝损伤具有一定的防治作用。     

霉形体在原代细胞内增殖的观察

对接种霉形体的原代细胞进行了电镜观察,结果如下:(1)进入细胞内的霉形体,不仅能以包涵体形式存在,也可以散在形式分布,同时还能进入粗面内质网等细胞器内.吸附在细胞膜上的霉形体、包涵体内的霉形体和散在于细胞质中的霉形体均可增殖,而进入细胞核内的霉形体未观察到增殖相.(2)在原代细胞内,正在进行出芽增殖的较大型霉形体内有一个线粒体.(3)进入细胞质中的霉形体,除具有出芽增殖和裂殖增殖形式外,在较大型霉形体内还观察到数个小球形霉形体.霉形体同时可以两种或3种方式增殖.(4)感染霉形体的细胞发生严重的空泡化,细胞体积增大.     

熊胆粉抗乙醇诱导的小鼠肝细胞氧化损伤研究

目的：研究熊胆粉对乙醇诱导的小鼠肝细胞氧化损伤的保护作用。方法：Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶和DNA酶联合消化分离、培养小鼠原代肝细胞,乙醇诱导小鼠肝细胞损伤,MTT法检测肝细胞存活率,不同浓度熊胆粉预处理肝细胞,观察培养液中丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果：乙醇对肝细胞的损伤呈量效关系,与正常对照组相比,损伤组培养液中MDA含量明显增加,GSH含量显著降低（P〈0.05）。熊胆粉保护各组（125,150,175μg·ml～（-1））与损伤组相比,培养液中MDA含量明显减少（P〈0.05）,GSH含量和SOD活性显著升高（P〈0.05）。结论：熊胆粉对乙醇诱导损伤的肝细胞具有明显的保护作用。