辣椒疫霉RxLR19781效应分子原核表达纯化及晶体生长条件的研选

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)侵染寄主细胞常分泌Rx LR效应蛋白分子,效应蛋白对寄主细胞具干扰或破坏作用。为了深入开展辣椒疫霉Rx LR效应蛋白分子功能特性机制的研究,本文利用PCR技术分离鉴定了辣椒疫霉效应分子Rx LR19781,以质粒p ET28a(+)为表达载体、大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,利用IPTG诱导Rx LR19781蛋白表达,通过亲和层析、离子交换层析及分子筛层析纯化获得高纯度蛋白,借助坐滴法培养优化获得Rx LR19781蛋白晶体,X射线衍射获得2.76?的蛋白晶体数据,以便解析Rx LR19781蛋白三级结构,有助立足Rx LR19781蛋白三级结构探索效应分子Rx LR19781功能机制特性,为构建新型病害防控策略和培育持久抗病辣椒品种提供理论研究。     

辣椒疫霉效应分子RxLR22034的表达纯化及晶体生长

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)作为一种重要的植物病原卵菌,侵染寄主植物时能够分泌RxLR效应分子,从而激活或抑制植物的防卫反应,引起植物病害的产生。为了深入研究辣椒疫霉效应分子与植物互作的机制及致病机理,本文从辣椒疫霉菌株SD33中克隆得到了RxLR22034效应分子,以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,进行了原核表达与纯化,确定了该基因高效表达条件。通过亲和层析及分子筛层析纯化获得高纯度蛋白,借助坐滴法培养优化获得RxLR22034蛋白晶体,X射线衍射获得2.7?的蛋白晶体数据,为后续解析RxLR效应分子蛋白三维结构,从结构生物学角度探知辣椒疫霉RxLR效应分子生理生化功能奠定了基础。     

植物病原真菌CFEM蛋白研究进展

病原真菌在侵染植物过程中,往往分泌效应因子增加致病性或被寄主抗病基因识别激发寄主强烈抗性,因此效应因子在植物-病原物的互作中发挥重要作用。CFEM(Common in Fungal Extracellular Membrane)蛋白是真菌中特有的一类位于细胞外膜的蛋白,往往起效应因子的作用。本文综述了植物病原真菌CFEM蛋白家族的结构特点,在不同物种中的表达和定位,CFEM蛋白对真菌胞内铁吸收和生长发育方面的调控作用,抑制寄主免疫反应和促进真菌寄生的作用机制以及CFEM蛋白起源和进化过程等方面的研究进展,同时对目前CFEM蛋白研究有待阐明的问题进行了讨论并展望了未来的研究方向。本文将有助于人们进一步了解植物-病原真菌互作分子机理以及CFEM蛋白的致病机理,为培育作物抗病品种和制定植物真菌病害防控策略提供参考。     

辣椒疫霉效应分子RxLR19781与其互作蛋白的酵母互作一对一验证

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是毁灭性土传病害,短期内暴发成灾,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌分泌大量的胞内效应分子,即RxLR效应分子,能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能,在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)系统是研究蛋白质相互作用最常用的方法,它既可以在cDNA文库中筛选互作的未知靶标蛋白,同时还可以验证两个目的蛋白之间的互作关系。本研究分别以辣椒疫霉c DNA基因组,辣椒cDNA基因组为模板,克隆了辣椒疫霉效应因子Rx LR19781以及其疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10和辣椒脂质转移蛋白EARLI 1,并将它们分别成功构建到PGBKT7和PGADT7载体上。运用酵母共转化技术,将带有AD载体的互作蛋白和带有BD载体的效应因子共同转化到酵母感受态Y2HGold中,对它们是否存在互作关系进行了深入研究。结果表明,两个疑似互作蛋白都与效应因子RxLR19781互作。但由于酵母双杂交存在一定的假阳性,因此该效应分子与互作蛋白的互作有待进一步深入的研究。     

真菌无毒基因克隆与抗性蛋白互作研究

无毒基因（avirulence genes, Avr）是病原物遗传因子,能诱发寄主植物产生抗病性。真菌Avr基因的克隆、编码产物结构和功能分析,以及与寄主抗性蛋白的互作机制等方面的研究对于深入了解植物的抗真菌病害分子机理具有重要意义。其编码AVR蛋白（又可以称为效应子,effector）通常富含半胱氨酸,效应子通过吸器或侵入丝被分泌到寄主细胞内促发抗性反应。在抗性反应过程中,效应子能直接或间接地被植物细胞相应的抗性蛋白识别,这种识别机制与效应子和抗性蛋白的区段相关。以几个真菌病害为例,综述了近年来有关无毒基因克隆、表达、以及与抗性蛋白的互作机制等方面的主要研究进展,以期为相关研究的深入提供参考。     

辣椒疫霉病无毒基因RXLR128001克隆与蛋白表达纯化

本文从强致病辣椒疫霉菌SD33分离克隆了1个效应分子RXLR128001基因,利用生物信息学软件BLAST and Signal P4.1 Server,分析了该效应分子的基因序列结构。在此基础上进行了该基因大肠杆菌(Escherichia coli)表达与纯化,界定了适宜该基因高效表达的诱导条件,经过亲和层析和离子交换层析,获得了RXLR128001基因较高纯度的蛋白,以利于后续晶体的培养与优化研究。     

植物病原细菌Ⅲ型分泌系统及Pseudomonas syringae pv.tomato的信号分子分泌研究进展

Ⅲ型分泌系统在植物病原细菌与寄主互作中起重要作用,许多革兰氏阴性致病菌通过该系统将效应蛋白注入寄主体内引发病害,综述了Ⅲ型分泌系统的特征、作用机理、与致病性的关系以及Pseudomonas syringae pv.Tomato的信号分子分泌研究进展.     

植物病原真菌及卵菌SNAREs基因功能研究进展

植物病原真菌和卵菌产生的效应蛋白在促进病原菌侵染、操纵寄主免疫方面有关键作用,这些效应蛋白在与寄主作用之前必须被分泌出去,SNARE蛋白家族作为真核细胞内囊泡转运及膜融合的关键组分,在分子转运中有核心调控作用。随着许多植物丝状病原菌基因组被破译,对SNAREs基因参与病原菌致病机制的研究取得了可喜进展。本研究简要概述了真核生物中SNARE蛋白的组成及分类和植物病原真菌及卵菌中SNARE蛋白基因的功能研究进展,并据此提出进一步开展SNARE蛋白基因功能分析的研究建议,以期为全面、深入研究植物病原真菌和卵菌中SNARE基因的功能、理解病原菌致病、效应蛋白分泌提供新的视野,为植物-病原物互作的分子机制研究提供参考。     

本氏烟中与番茄斑萎病毒N蛋白互作的寄主因子的筛选

[目的] 番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)是植物多分体负义链RNA病毒的代表性成员.TSWV的N蛋白在病毒感染的寄主植物内表达量高,可能调控病毒对寄主的感病,探究N蛋白通过影响哪些寄主蛋白的表达来完成病毒的侵染,以期为深入解析寄主蛋白调控病毒的分子机制提供理论基础,为后续有...     

松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的原核表达与活性测定

[目的]纯化获得松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1并验证其体外活性,为后续研究效应蛋白Bx-FAR-1参与松材线虫侵染松树的分子机制打下基础.[方法]利用PCR技术从松材线虫cDNA中扩增出效应基因Bx-FAR-1,用同源重组的方式将目的片段连接至原核表达载体pET-32a(+).通过原核表达系统诱导并纯化获得大量效应蛋白Bx-FAR-1,利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting对纯化获得的蛋白进行鉴定,同时通过本氏烟瞬时表达系统验证蛋白活性.[结果]从松材线虫cDNA中成功扩增出Bx-FAR-1基因(BXY_1685000.1);通过同源重组成功获得重组表达载体pET32a-BxFAR,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞.当诱导条件为15℃下150 r/min诱导16 h时重组蛋白以可溶性形式表达,且蛋白表达量高.效应蛋白Bx-FAR-1活性测定结果显示,当蛋白浓度达100 nmol/L时,可抑制致病疫霉的病原相关分子模式(PAMP)INF1引起的烟草细胞坏死.[结论]松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1可抑制寄主植物的免疫反应.     

利用酵母双杂交技术筛选卵菌效应因子互作蛋白概述

蛋白质是生命活动的执行者,其通过与DNA、RNA、蛋白质、脂类以及多糖等物质结合形成复合体以参与信号转导、防卫反应等复杂的生命活动,因此研究蛋白质之间相互作用可为揭示生命现象本质提供依据。酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)系统是筛选互作蛋白最常用的方法,它具快速、灵敏、简便、高效、广泛的优点。卵菌是一类危害严重的植物病原菌,可分泌效应因子,直接或间接与寄主体内的蛋白发生作用从而促进病原菌侵染与定植,引起寄主发病或者干扰、抑制寄主的抗病反应,但目前对于病原卵菌效应因子的寄主靶标以及效应因子增加寄主对病原菌的敏感性机制知之甚少,因此,利用酵母双杂交技术筛选植物病原卵菌效应因子互作蛋白,为探明其致病机制显得尤为重要。     

花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技术构建表达载体

【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用Gateway技术构建ERF114基因的植物表达载体。【结果】克隆获得了花椰菜ERF114基因,其全长为681 bp,编码226个氨基酸,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该蛋白质为亲水性蛋白,有1个跨膜区域,二级结构以α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲结构为主。进化树分析表明,花椰菜ERF114与油菜的亲缘关系最近。同时成功构建了植物表达载体。【结论】成功克隆了花椰菜ERF114基因,对其进行生物信息学分析,并构建其表达载体,为探究花椰菜ERF114基因功能及分子调控机制奠定了基础。     

西瓜专化型尖孢镰刀菌FonSIX6缺失突变体的构建

病原菌和植物相互作用时分泌效应蛋白（effectors）抑制植物的防卫反应。枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的真菌病害,尖孢镰刀菌和寄主相互作用时分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白（15.8～29.9 kD）进入木质部启动致病力,称为SIX（secreted in xylem）蛋白,其中,SIX6蛋白是一个效应蛋白。西瓜枯萎病是由西瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.Niveurn,Fon）引起的真菌病害。为了明确FonSIX6在侵染西瓜时的作用,克隆了该基因的上下游序列,以潮霉素为筛选标记构建了该基因的缺失突变体载体pDH\|SIX6;将构建好的基因缺失载体转入农杆菌AGL\|1中,通过农杆菌介导的遗传转化和转化子的筛选获得了FonSIX6基因的缺失突变体。     

玉米大斑病菌全基因组候选效应分子的预测和分析

大斑病是一种世界性玉米叶部病害,可造成玉米产量严重降低,其致病菌大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)可在叶片形成坏死斑,影响玉米品质并造成严重经济损失。效应分子在植物病原真菌对植物侵染过程中发挥着重要作用。根据玉米大斑病菌Et28A菌株全基因组信息,利用Signal P、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和TargetP生物信息学软件和预测程序对玉米大斑病菌中11698条蛋白序列进行候选效应分子预测,再通过对上述蛋白半胱氨酸含量、信号肽长度及冗余性分析,获得60个符合条件的候选效应分子,其中大部分为功能未知的假定蛋白。利用生物信息学方法预测出玉米大斑病菌的候选效应分子,为进一步研究效应分子在病原菌与玉米互作中的作用奠定了基础,并为其他病原菌效应分子的预测及分析提供了参考。     

辣椒疫霉中一个具有转录因子序列特征的外泌蛋白的分析鉴定

植物病原细菌分泌核调控蛋白进入寄主细胞核调控其基因表达以利于自身的侵染,但目前对卵菌中该类蛋白知之甚少.前期生物信息学分析从辣椒疫霉中获得一个具有DNA结合域的外泌蛋白PcSEP9,利用qRT-PCR检测其在辣椒疫霉侵染前期(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢萌发)和侵染阶段[灌根接种本氏烟(Nicotiana ben...     

甲醇毕赤氏酵母表达体系

甲醇毕赤氏酵母体系是最近才发展起来的商业化外源蛋白生产的重组寄主系统,为分子发酵工程最新的酵母表达体系这一研究领域提供了参考。根据国外研究成果,介绍了该酶母体系的生物学特性,载体及宿主分子生物学;阐述了毕赤氏酵母表达策略及发酵策略,并揭示了利用该系统进行了基因工程研究和商业化外源蛋白生产的潜力。     

菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

[目的]克隆菊花CmAPETALA1基因(CmAP1)并构建植物表达载体,为该基因功能的遗传改良打下研究基础.[方法]采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因,运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析,利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析,并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接,构建植物表达载体.[结果]克隆获得的CmAP1基因(GenBank登录号KU872999)编码区开放阅读框(ORF)长741 bp,编码246个氨基酸;CmAP1蛋白属亲水性蛋白,分子质量约28.3 kD、理论等电点(pI)为8.76,预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明,CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%,属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支;实时荧光定量PCR分析结果表明,CmAP1基因在花蕾中表达量极高,在舌状花和筒状花中表达量较低,而在营养器官中仅痕量表达.将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上,可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1.[结论]CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用,成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改变菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础.     

马铃薯Y病毒属病毒与寄主互作的分子机制研究进展

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒是重要的植物病原物。寄主感病后,随着病毒-寄主互作情况的不同病害整体表现不同。综合分析Potyviruses与寄主互作的分子机制新近研究成果,可将病毒与寄主互作途径归纳为3个方面:一是病毒-寄主互作改变细胞局部区域内信号分子(Ca2+)和植物激素(如茉莉酸)的浓度,进而影响寄主信号转导通路;二是病毒-寄主互作改变了寄主基因转录组并影响寄主miRNA分子及其靶基因的功能;三是病毒-寄主间的蛋白分子互作介导了病毒的复制与细胞间运动。另外,细胞内的质膜结构可将病毒隔离在一个安全区域,以逃避寄主的防御系统。     

植物病原真菌致病分子机理的研究进展

综述了植物病原真菌致病分子机理的研究进展,围绕植物病原真菌粘附寄主表面、侵染结构的形成、侵入寄主、在寄主内定殖与扩展四个侵入寄主的主要步骤,进行分子解析的阐明,有助于更好的评估病原真菌致病性的影响,并对今后的工作进行了展望.