农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体p CAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

棉花黄萎病菌T DNA插入突变体库的构建及变异性状的分析

利用农杆菌介导遗传转化(ATMT)的方法,成功构建含2 000个转化子的棉花黄萎病菌强毒菌株Vd080的突变体库。200μmol/L乙酰丁香酮(AS)作诱导剂,25℃共培养48h,棉花黄萎病菌孢子量为106 mL-1,其转化效率达150～540个转化子。进一步研究发现,供试突变体的T-DNA成功插入Vd080基因组,且均为单拷贝插入,转化子的潮霉素B基因能够稳定遗传。309个突变体中,53.7%的突变体菌落形态与初始菌株Vd080相同,均产生黑色的微菌核,不产生黑色素微菌核的菌丝型仅占17.5%。与初始菌株相比,随机选取的85个突变体,产孢量、生长速率、粗毒素分泌量及致病力发生显著变异的菌株分别占36.4%、12.9%、50.6%和29.4%,四者之间不存在明显的相关性。     

柱花草炭疽病菌T-DNA 插入突变体库的构建与分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的柱花草炭疽病是热带牧草柱花草的主要病害,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)的T-DNA插入突变技术,可使炭疽病菌基因组上被插入部位的基因丧失功能,是研究柱花草炭疽病菌致病机理的重要方法.在先前优化根癌农杆菌介导柱花草炭疽病菌遗传转化体系的基础上,构建了4 616个转化子的突变体库,从中随机选取部分突变体,对其T-DNA插入拷贝数、遗传稳定性、生长速度、产孢量、分生孢子萌发等进行分析.结果表明,所得转化子多为单拷贝,能稳定遗传.一些转化子的生长速度、产孢量、分生孢子萌发率与野生型相比有明显差异.     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

根癌土壤杆菌介导棒形青霉的遗传转化

为实验室棒形青霉的功能基因研究奠定基础,采用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化方法,以棒形青霉的分生孢子为受体,p DHt-sk-hyg为双元载体,成功实现棒形青霉的遗传转化。结果表明:棒形青霉对潮霉素B比较敏感,30μg/m L就可以抑制其生长;遗传转化的效率为70~90个转化子/106个分生孢子,连续转接5代能够稳定遗传;转化子的PCR检测表明,潮霉素磷酸转移酶标记基因已整合到棒形青霉的基因组中,转化子的遗传表现稳定。     

中国部分省份苹果轮纹病菌及相关类群的系统学关系

【目的】对苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）及其相关类群的rDNA-ITS序列进行分析,探讨他们之间的系统学关系,为进一步研究其系统发育和演化提供理论依据。【方法】对来源于陕西、山西、山东、河南及四川5个省份的113株苹果轮纹病菌和2株梨轮纹病菌的rDNA-ITS区段直接测序,经GenBank同源性检索比对（BLASTn）及DnaSP 4.0软件分析后,结合GenBank下载序列构建系统发育的邻接树和最大简约树,同时计算遗传距离和序列核苷酸差异数。【结果】115株供试菌株分为9个单倍型（Hap₁～Hap₉）,其中Hap₇（B.obtusa）来源于山西省;Hap₉（苹果壳色单隔孢溃疡病菌,B.stevensii）来源于四川省;其余单倍型均为B.dothidea,其中Hap₁的出现频率最高,包含86株分离株。邻接法和最大简约法分析结果显示,用于构建发育树的序列均形成了3个大的聚类组。聚类组Ⅰ包含B.obtusa、B.rhodina（柑橘葡萄座腔菌）和B.stevensii等3个种,其中B.obtusa和B.rhodina各自独立聚为一支,而B.stevensii全部序列分为3支。聚类组Ⅱ包含2个分支:其中B.lutea单独聚为一支;B.ribis（茶麃子葡萄座腔菌）和B.parva亲缘关系较近,共同聚为一支。聚类组Ⅲ由B.dothidea和贝伦格葡萄座腔菌（B.berengeriana）共同构成,支持B.dothidea与B.berengeriana为同物异名的观点。遗传距离及序列核苷酸差异数显示,B.dothidea与其他种间的遗传距离在4.91%～7.57%,序列核苷酸差异数为31～54bp;B.dothidea不同单倍型之间的遗传距离为0.19%～1.93%,序列核苷酸差异数为1～10bp。【结论】B.stevensii显示出了复合种的特性,其分类地位还有待于进一步研究。B.dothidea与其他相似种的亲缘关系较远,且在B.dothidea种内存在核苷酸序列的分化,但分化程度较低。B.dothidea不同地理来源的菌株之间存在差异,但地理分化特征不明显。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌致病力降低T-DNA突变体的筛选与插入位点鉴定

为深入研究水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum Schelcht）致病分子机理,利用根癌农杆菌介导遗传转化技术构建尖孢镰孢菌突变体库,筛选致病力降低突变体,检测其T-DNA插入数量和位点。结果表明,691个突变体库构建成功,且突变体可稳定遗传后代。选取34个不同菌落形态变化突变体测定其致病力,筛选到6个致病力降低最严重突变体,分析其菌落形态、菌落生长速率和产孢量。与野生型相比,菌落形态存在差异,其中4个突变体B9、C36、D65、E17生长速率降低,6个突变体产孢数量均降低。通过Southern blot分析发现突变体B92有两个T-DNA插入,其余5个突变体为单个T-DNA插入,利用Hi TAIL-PCR确定6个突变体T-DNA插入位点。结果有助于更好理解尖孢镰孢菌与水稻之间分子相互作用,为进一步确定尖孢镰孢菌致病基因及其功能提供参考。     

杆菌介导灰葡萄孢菌株RoseBc-3的遗传转化

观察了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株RoseBc-3的影响因素,并对遗传转化的有效性进行评估.结果表明:农杆菌与灰葡萄孢共培养的温度和灰葡萄孢分生孢子浓度均能影响转化效率,当共培养温度为22℃、灰葡萄孢分生孢子浓度为1×105个/mL时,转化效率最高,平均每平皿(直径9 cm)转化子数量超过100个;通过特异性引物介导的PCR和特异性探针杂交方法,证明所获得的转化子是农杆菌中T-DNA插入造成的,且大多数(87.5％)T-DNA插入为单拷贝插入;从灰葡萄孢T-DNA插入体库筛选获得了6类突变体,即产孢显著减少或不产孢突变体(占3.8％)、菌丝生长速率减慢突变体(占3.5％)、菌丝稀疏突变体(占1.6％)、菌落颜色异常突变体(占5.7％)、致病力丧失突变体(占3.3％)和致病力增强突变体(占3.0％).采用反向PCR技术和hi-TAIL PCR技术从14个灰葡萄孢突变体菌株中获得了T-DNA侧翼序列,且发现T-DNA在基因编码区和非编码区插入的频率是相同的.     

根癌农杆菌介导gfp基因转化水稻纹枯病菌及其对病原菌稳定性和致病力的影响

本文对根癌农杆菌介导gfp基因转化水稻纹枯病菌及其对病原菌稳定性和致病力的影响进行了系统研究。结果表明,30μg/m L潮霉素B可作为转化子的筛选浓度,水稻纹枯病菌遗传转化的最佳条件为:共培养AS浓度为250μmol/m L,预诱导时间为9 h,共培养温度为26℃,共培养时p H为5.8~6.0,共培养时间为22 h。分别对随机选取的5个转化子进行荧光显微镜观察、PCR扩增及测序。结果表明,绿色荧光蛋白基因gfp已成功转化到水稻纹枯病菌中。转化子稳定性及致病力鉴定结果表明,转化子连续转接5代后仍对潮霉素B具有抗性,表明gpf成功转化到水稻纹枯病菌中且稳定遗传。转化子与野生型水稻病菌导致的水稻发病程度基本一致,表明gfp遗传转化后对水稻纹枯病菌的致病力无显著影响。本研究结果为开展水稻纹枯病菌与水稻品种互作机制奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的深绿木霉菌T23遗传转化研究

采用根癌农杆菌介导的方法,成功地建立了丝状生防真菌深绿木霉（Trichoderma atroviride）菌株T23的遗传转化体系。并且,通过提高筛选培养基中潮霉素B的浓度和调整农杆菌的培养时间,对转化体系作了进一步的优化。转化效率约为50个突变体／10^7个分生孢子。所有转化子经继代培养5代,潮霉素B抗性筛选后,共得到118个遗传稳定的转化子。随机抽取部分转化子,进行PCR和soutllem blot分子鉴定,结果证实外源的T—DNA已经随机整合到T23的基因组中。通过形态学观察,筛选出3个在产孢量和菌丝体生长速度方面显著不同于野生型菌株T23的转化子。农杆菌介导的遗传转化方法在深绿木霉菌株T23上的成功运用,将为研究该菌的功能基因组提供强有力的工具。     

豌豆小叶突变基因(af)的遗传及其育种利用

 以半无叶类型、普通类型豌豆为试验材料 ,对小叶突变基因、子叶颜色基因和初花节位基因的遗传距离进行了研究。结果表明 ,小叶突变体性状受单基因控制 ,呈完全隐性 ;小叶突变体基因af、子叶颜色基因i、初花节位基因lf表现为连锁遗传 ,且位于第一染色体 ;测得小叶突变体af基因和子叶颜色基因i之间的遗传距离为 6 .71个遗传单位 ,小叶突变体af基因和初花节位基因lf的遗传距离为 44 .44个遗传单位 ,3对基因之间的顺序为lf、i、af。af基因在育种上有重要的利用价值 ,利用af基因已培育出超高产、优质豌豆新品种宝峰 3号。     

根癌农杆菌介导的CryⅠA(b)基因在毛壳菌中的转化

利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法,将CryⅠA(b)基因转入生物防治真菌毛壳菌中,转化率约为40～180个转化子·10-7个孢子。通过对转化子的RT-PCR检测和Southern杂交分析表明,CryⅠA(b)基因已整合进毛壳菌基因组中,而且在转录水平上得到表达,转化子都能够稳定遗传。根癌农杆菌介导的遗传转化具有高转化率、低拷贝、遗传稳定、操作简便等优点,因此有可能成为丝状真菌遗传转化和功能基因组研究的有力工具。     

根癌农杆菌介导的Cry I A(b)基因在毛壳菌中的转化

利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法,将CryⅠA(b)基因转入生物防治真菌毛壳菌中,转化率约为40～180个转化子·10-7个孢子。通过对转化子的RT-PCR检测和Southern杂交分析表明,CryⅠA(b)基因已整合进毛壳菌基因组中,而且在转录水平上得到表达,转化子都能够稳定遗传。根癌农杆菌介导的遗传转化具有高转化率、低拷贝、遗传稳定、操作简便等优点,因此有可能成为丝状真菌遗传转化和功能基因组研究的有力工具。     

农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化

建立并优化了农杆菌介导转化瓜类炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)获得T-DNA插入突变体体系,包括农杆菌使用浓度、农杆菌与炭疽菌孢子共培养时间、抗生素配合使用抑制农杆菌污染等.所用的转化载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP除了抗生素选择标记外还携带有融合GFP-GUS报告基因.转化106个孢子平均可获得约150～200个潮霉素抗性转化子.PCR检测表明,所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到转化载体中的GUS基因片段,而且都能产生GFP荧光或GUS染色阳性.转化子菌株经过连续继代培养后保持稳定.随机对36个转化子菌株进行致病性测定,发现1个转化子菌株对黄瓜致病性下降,1个丧失致病性,而大多数表现为野生型致病性.农杆菌介导转化瓜类炭疽菌体系的建立,为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础.     

香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T-DNA插入突变体的筛选

[目的]通过农杆菌介导的遗传转化(ATMT)方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究.[方法]通过单因子变量(试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度)试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体.[结果]得到的最佳转化条件为:农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜.通过条件优化,转化效率可达到800~900个转化子/106个孢子.[结论]通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础.     

农杆菌介导的绿木霉ZBS6的T-DNA转化研究

应用农杆菌介导的T - DNA转化技术,成功转化了生防绿木霉(Trichoderma viride)ZBS6,共获得368个转化子,转化效率为每106个分生孢子产生92个转化子.PCR和Southern blot分子鉴定以及遗传稳定性测定结果表明:转化子T - DNA插入率为90％,均能够稳定遗传,且T-DNA单拷贝插...     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

大丽轮枝菌菌核型菌株T-DNA插入突变体库的构建及微菌核发育异常突变体的筛选

为阐明大丽轮枝菌微菌核形成发育的分子机理,利用农杆菌介导的遗传转化方法,建立了包含2 000个转化子的大丽轮枝菌菌核型菌株V08DF1的T-DNA插入突变体库,并在查氏、查氏-根或PDA培养基上培养,观察各转化子的菌落形态。从中筛选出130个菌落特征与野生型菌株V08DF1有明显差异的突变体菌株,其中14个突变体菌株为微菌核发育受阻。对这14个微菌核发育异常的突变体菌株进行T-DNA插入的PCR验证,均能扩增到潮霉素抗性基因,Southern杂交显示其中7个为单拷贝插入,5个为双拷贝插入,2个为三拷贝插入,表明T-DNA已经成功整合到这些突变株的基因组DNA中。