林麝粪便基因组DNA的提取及PCR扩增

【目的】探索从林麝粪便中提取基因组DNA并进行物种鉴定的可行性,为林麝野外调查工作以及分子粪便学在林麝保护中的应用提供科学依据。【方法】采集林麝粪便,采用改良的CTAB抽提基因组DNA;按常规PCR法对mtDNA D-loop区和Cyt b基因进行扩增测序后,用DNAMAN 6.0软件进行系统发育分析;在不同温度存放不同时间,研究林麝粪便基因组DNA的提取与mtDNA D-loop区和Cyt b基因PCR扩增的时效性。【结果】以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增均能特异性地扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。系统发育分析结果表明:所扩增产物为林麝的mtDNA D-loop区和Cyt b基因。时效性分析结果显示:常温和4℃条件下保存96h以内的林麝粪便所提取的基因组DNA能有效扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。【结论】自然条件下林麝粪便中林麝自身体细胞DNA保存时间较长,通过在野外采集林麝粪便提取基因组DNA并进行物种鉴定是可行的。     

Cyt b和12S rRNA基因进化速度对构建系统进化树的影响

[目的]论证线粒体Cyt b和12S rRNA基因不同进化速率影响构建的系统树拓扑结构。[方法]从GenBank下载了蛇亚目12科15种蛇线粒体全序列,提取Cyt b和12S rRNA基因序列,选用GTR＋I＋G核苷酸替代模型,基于最大似然法,用PAUP4.0软件分别构建2个基因的系统关系树。[结果]在选用相同的软件、建树方法和研究物种的情况下,构建的系统树拓扑结构差异主要是因为线粒体Cyt b和12S rRNA基因进化速率不同产生的。[结论]在分子系统进化研究中,要针对不同的研究物种和研究目的,选择合适的基因构建系统进化树。     

基于线粒体COI基因的DNA条形码技术对小叶蝉亚科昆虫种类的分子鉴定

【目的】为更进一步研究小叶蝉亚科昆虫分子鉴定技术提供理论依据和实践基础。【方法】以小叶蝉亚科:叉脉叶蝉族Dikraneurini、小叶蝉族Typhlocybini、小绿叶蝉族Empoascini、斑叶蝉族Erythroneurini、眼小叶蝉族Alebrini昆虫为研究对象,选取其中22种叶蝉测定分析线粒体COI基因646 bp碱基序列,运用Kimura 2-parameter模型分析叶蝉物种间的遗传距离,探讨线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因片段作为DNA条形码准确鉴定小叶蝉亚科昆虫种类的可行性。【结果】变异位点512个,保守位点134个,简约信息位点415个,自裔位点97个。所有位点中A、G、C和T碱基含量分别为27.6%、15.5%、15.3%和41.6%;A+T含量较高,为69.2%,明显高于G+C含量,A+T碱基偏嗜,符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。该段序列没有饱和,可以得到准确的进化分析。同物种间和不同物种间的遗传距离分别为0.025～0.044和0.024～0.291,平均为0.358。基于COI基因序列应用邻接法构建系统发育树(NJ树)显示,同一物种聚为同一小支,分支自展值均为100%:近缘种能聚集在一起,且置信度很高(≥97%)。【结论】昆虫COI序列能够区分不同物种,COI基因片段的DNA条形码进行小叶蝉亚科昆虫分类鉴定具有可行性。     

一株具有烟草甲幼虫毒杀作用苏云金芽孢杆菌的遗传多样性分析及cry基因鉴定

【目的】明确一株具有烟草甲幼虫毒杀作用苏云金芽孢杆菌在蜡样芽孢杆菌群中的进化关系,并对该菌株所携带的cry基因进行鉴定,为其在农业上的开发应用提供参考依据。【方法】对苏云金芽孢杆菌GXZY032菌株的16S rRNA和gyrB基因序列进行PCR扩增测序,并进行相应的进化树分析;使用PCR技术对GXZY032菌株基因组所包含的cry杀虫基因进行鉴定。【结果】菌株GXZY032的16S rRNA序列经PCR扩增得到1.5 kb片段,在进化树中以较低的置信值与多个BtII群菌株聚到一起。gyrB基因序列经PCR扩增并测序得到1.2 kb片段,所构建的进化树有6个置信值较高的分支,构成BtI、BtII、B.cereus I、BtIII、Bt+Bw和Bt+Ba 6个群,其中菌株GXZY032的序列与BtII群聚集一起,置信值为99%。对8种cry基因进行PCR鉴定,结果表明,菌株GXZY032包含cry1、cry2和cry10 3种类型cry基因。【结论】苏云金芽孢杆菌菌株GXZY032属于BtII群,具有cry1、cry2和cry10 3种类型cry杀虫基因。     

稻蝗属特异性SCAR分子标记的鉴定

【目的】研究稻蝗属特异性DNA分子标记,为稻蝗属物种的分类鉴定提供快速有效的分子检测方法。【方法】基于稻蝗属物种及其近缘属种的大量RAPD-PCR结果,筛选出稻蝗属物种特异性的RAPD条带,对该特异RAPD条带进行克隆、测序。基于所测序列设计特异引物,以稻蝗属不同物种和蝗总科其它物种基因组DNA为模板进行PCR扩增。【结果】随机引物S823可在稻蝗属不同物种扩增出约650bp的RAPD条带,经对该条带的克隆、测序,发现在3个受试的稻蝗属物种中序列同源度达92.3%—96.6%,序列G+C含量大于15%,并富含大量的A、T重复区;基于已知序列设计的特异引物对稻蝗属7个物种可以扩增出目的条带(550bp),而对赤胫伪稻蝗及蝗总科其它物种均无扩增条带。【结论】鉴定了稻蝗属特异的RAPD条带,基于该条带序列设计的特异引物可用于稻蝗属物种的快速分子鉴定。     

基于ITS2 DNA条形码的苞叶雪莲分子鉴定

【目的】基于ITS2条形码技术鉴定藏药材苞叶雪莲,以保证药材质量,确保用药安全。【方法】对采自西藏林芝的苞叶雪莲进行DNA提取,PCR扩增得到ITS序列并测序;所有样品的ITS2序列采用基于隐马尔可夫模型(HMM)的注释方法获得,使用MAGE6.0进行多重序列比对,并构建进化树,同时预测苞叶雪莲ITS2序列的二级结构。【结果】苞叶雪莲及其近缘物种的ITS2序列间存在明显差异,基于ITS2序列的NJ树及ITS2二级结构能将苞叶雪莲及其近缘物种区分开。【结论】ITS2序列可以有效的鉴别苞叶雪莲及其近缘物种,可以为苞叶雪莲的安全用药及合理开发利用提供依据。     

大别山区赤腹松鼠物种识别的分子遗传学研究

为确定在大别山地区采集到的一个Callosciurus属松鼠样本的物种归属及分类地位,利用分子遗传学手段的对所采样本进行研究。采用Cyt b基因结合PCR技术、测序技术及BLAST技术分析样本的遗传信息,再通过MEGA建树确定样本的分类地位。BLAST分析结果显示该物种的遗传信息与赤腹松鼠序列相似程度最高,而建树结果显示与赤腹松鼠聚为同一支,从而确定该物种应为赤腹松鼠,属哺乳纲、啮齿目、松鼠科、丽松鼠属。     

甘蔗近缘属种23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列分析

【目的】探讨叶绿体23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种系统进化中的应用,为深入研究甘蔗近缘属种系统进化提供参考。【方法】以14个甘蔗近缘属种材料为研究对象,测序分析其23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列,并应用BLAST分析其在禾本科中的变异情况。【结果】23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在14个甘蔗近缘属种材料间的同源性为100%,属于高度保守区域,但在禾本科各亚科间表现出一定的变异,且在各亚科中都存在其特异的变异位点。【结论】23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种间属于高度保守的区域,不适合用于甘蔗近缘属种间系统进化的分析,但可为禾本科亚科系统进化的分析提供有用的信息。     

柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列的克隆及分析

 【目的】克隆柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列并和亚洲种相应区域进行比对,阐明黄龙病3个种核糖体RNA操纵子之间的关系。【方法】根据亚洲种23S-5S rRNA基因区域序列的保守性设计引物,在非洲种和美洲种DNA样品上扩增,对PCR产物进行克隆和测序,并对新获得的序列进行序列验证和分析。【结果】 非洲种获得了3 057 bp 序列包括23S rRNA 基因、细胞壁脱氢酶假基因和5S rRNA 基因;美洲种获得了3 033 bp序列包括23S rRNA 基因、glpK基因和5S rRNA 基因。3个种核糖体基因顺序分别是：亚洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因、5S rRNA 和 tRNAMet;非洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因和 5S rRNA;美洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、glpK 基因和5S rRNA。【结论】黄龙病病原菌核糖体RNA基因有特殊的排列方式,即在23S rRNA和5S rRNA基因区间均有反向编码的细胞壁脱氢酶基因,其中亚洲种和非洲种为假基因,美洲种为glpK基因。     

紫外诱导下麦长管蚜细胞色素b基因和SOD基因的克隆与序列分析

【目的】证实前期消减文库的研究结果,揭示紫外诱导条件下麦长管蚜的生态遗传机理。【方法】根据前人研究证明的细胞色素b基因和SOD基因的保守性区域,设计特异性引物,采用RT-PCR方法,扩增紫外线照射24,48h和对照麦长管蚜变异基因的部分序列,进行测序及核苷酸分析,并推导氨基酸序列。【结果】RT-PCR扩增分别得到长度420bp的细胞色素b基因cDNA片段和357bp的超氧化物歧化酶(SOD)基因cDNA片段。序列分析表明,细胞色素b基因编码140个氨基酸残基,30W紫外辐射48h处理的麦长管蚜细胞色素b基因突变位点为3个,其编码的氨基酸序列变异位点为2个;SOD基因编码119个氨基酸残基,且对照与处理的序列一致,未发现变异位点。【结论】紫外诱导条件下,麦长管蚜细胞色素b基因发生突变部分的具体位点已经找到,其突变方式为转换和颠换;SOD基因未发现变异位点。