黄瓜花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

对侵染烟草的黄瓜花叶病毒(CMV)山东分离物(SD1)的外壳蛋白(CP)基因进行克隆和序列分析。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成两条寡聚核苷酸引物,用免疫捕捉PCR的方法对黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因进行了扩增。将所得的PCR产物通过T4DNA连接酶连接到pET-22b(+)载体上,并转化大肠杆菌DH5α。序列分析表明:CMV-SD1的CP基因全长657bp,编码218个氨基酸;其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ的分离物有极高的同源性,达92.7%~94.9%;与亚组Ⅱ的同源性仅为59.3%~59.5%;由此将CMV-SD1分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

黄瓜花叶病毒强毒株外壳蛋白基因克隆和序列分析

在辣椒上分离到一株黄瓜花叶病毒分离物CP310，对其进行14种寄主植物生物学反应测定，发现CP310在心叶烟、克里夫兰烟等植物上表现致死症状，在番茄、烟草表现为植株明显矮化。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成引物，采用常规RT-PCR方法对其外壳蛋白基因进行扩增并克隆，序列分析结果显示：该分离物外壳蛋白基因全长657个核苷酸，编码218个氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列与所比较的CMV亚组I的分离物有很高的同源性，分别为91．0％～94．7％和96．0％～98．2％．与CMV亚组Ⅱ的同源性分别仅为76．6％～78．0％和76．0％～78．9％。     

北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花叶病毒CP基因序列分析及亚组鉴定

从宁夏和北京地区甜椒上分离到3个黄瓜花叶病毒分离物(宁夏分离物为CMV-NX1,NX2;北京分离物为CMV-BJ)并保存在普通烟上。从叶片中提取该病毒RNA,经RT-PCR扩增到780bp的全长CP基因的cDNA,PCR产物纯化并测序。2个宁夏分离物(NX1,NX2)核甘酸序列同源性为100%,它们为同一株系。与已报道的部分CMV株系的CP基因序列相比较,表明3个分离物与CMV亚组I同源关系比亚组II更密切,因而3个分离物都属于黄瓜花叶病毒亚组I,通过DAS-ELISA进一步验证它们都属于亚组I。     

鲁粤两省黄瓜花叶病毒辣椒分离物CP基因序列分析及亚组鉴定

从广东和山东呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到2个黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的分离物.利用RT-PCR技术克隆了病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因.核苷酸序列测定表明,CMV-GDLJ和CMV-SDLJ 2个病毒分离物CP基因序列长度为657bp,编码218个氨基酸.2个病毒分离物的CP基因序列与CMV亚组Ⅰ的6个株系CP基因序列同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ的3个株系同源性均低于80%,据此将分离物CMV-GD和CMV-TA归属于CMV亚组Ⅰ.     

云南胡椒花叶病病原检测及亚组鉴定

利用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对采自云南的胡椒花叶病样品进行检测.结果表明,云南胡椒花叶病的病原为黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV),命名为CMV云南胡椒分离物(CMV-YNP).利用RT-PCR对CMV-YNP外壳蛋白(Coat protein,CP)基因进行克隆,获得大小为657 bp的基因序列.序列分析表明,CMV-YNP与从不同地域感病胡椒中分离的其它CMV株系虽同属CMV IB亚组,但并没有聚在一簇,而且与它们的cp基因存在较大差异,核苷酸序列相似性仅在92%~94%.     

黄瓜花叶病毒紫松果菊分离物外壳蛋白特性分析

以紫松果菊上分离的黄瓜花叶病毒2-1-2的RNA为模板,采用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应,下同)技术对2-1-2的外壳蛋白(coat prote in,CP)基因进行了克隆和序列测定。该CP基因全长657个碱基,编码218个氨基酸。其核苷酸序列和推导的氨基酸序列与亚组I代表株系Fny的同源性分别为94.5%和98.1%,与亚组II代表株系Q的同源性分别为77.7%和82.5%。对包括该分离物在内的20个CP序列与地域之间的关系进行了分析,结果表明CMV不同分离物的亚组类型与地域无明显关系。     

辣椒CMV广州分离物的CP基因序列分析及亚组鉴定

从广州市呈现花叶病症的辣椒上分离纯化得到1个黄瓜花叶病毒的分离物(CMV-GZ)。利用RT-PCR技术克隆了该病毒分离物的外壳蛋白(CP)基因,其序列长度为657 bp,编码218个氨基酸。对CP基因序列进行同源性比较分析,结果表明该病毒分离物的CP基因与CMV亚组Ⅰ5个株系的同源性均在90%以上,而与亚组Ⅱ4个株系的同源性均低于80%。据此将该分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

山西西葫芦花叶病病原鉴定与部分序列分析

利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病西葫芦进行了分子鉴定。序列测定及分析发现,具有明显花叶和斑驳症状的西葫芦受到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的侵染。为进一步明确黄瓜花叶病毒山西西葫芦分离物(CMV-XHL)的分类地位,克隆了CMV-XHL RNA3的外壳蛋白和移动蛋白基因全序列。通过序列比对分析,发现CMV-XHL CP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组ⅠB中CMV烟草分离物(CMV-SG)的相似性最高,分别为98.6%和99.5%;MP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物的相似性最高,为93.2%~94.6%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CMV-XHL与中国大多数CMV分离物聚为一类,属于CMV亚组Ⅰ中的成员。研究结果对西葫芦病毒病的防治提供一定的理论依据。     

黄瓜花叶病毒亚组研究进展

综述了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组研究的进展．根据寄主反应、血清学关系、病毒外壳蛋白肽链图谱分析、ｄｓＲＮＡ分析、核酸杂交、ＲＴ－ＰＣＲ产物酶解分析及核酸序列分析等方法,可将现有ＣＭＶ株系或分离物区分成２个亚组,尤其是利用单克隆抗体、核酸杂交、ＰＣＲ及核酸序列分析,能准确地将不同亚组的分离物区分开．从已知序列的ＣＭＶ株系分析,不同亚组株系的核苷酸序列同源率各ＲＮＡ组分仅为５８％～７５％,同亚组株系的核苷酸序列同源率则达８６％～１００％．将ＣＭＶ株系或分离物区分成２个亚组反映了它们之间的进化关系．文章最后就我国ＣＭＶ亚组的研究提出看法和建议     

芜菁花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 从山东省3地市感病的白菜和萝卜上分离到芜菁花叶病毒6个分离物，将其分别命名为TuMV-SD1、TuMV-SD2、TuMV-SD3 、TuMV-SD4、 TuMV-SD5和TuMV-SD6。利用RT-PCR克隆了这6个分离物的外壳蛋白基因，测定了它们的核苷酸序列，并进行了序列分析。结果表明，6个分离物的CP基因均为867个碱基，核苷酸序列同源性较高, 达97.0%～99.4%；它们与World-B组分离物的同源性最高，达91.8%～100%；与Brassica- Raphanus (BR) 致病型分离物的同源性次之，在89.1%～91.0%之间；与basal-B组分离物的同源性最低，仅86.0%～90.3%。基于TuMV的CP基因核苷酸序列的分子进化树显示，TuMV分离物可分为4组，本研究所分离到的6个TuMV山东分离物属于第四组，即world-B组。用分离到的6个TuMV分离物对已获得的转TuMV CP基因的抗病毒大白菜进行攻毒试验。结果表明，尽管作为转基因的CP基因与这6个分离物的CP基因只有88.2%～88.9%的同源性，但转基因大白菜对这6个分离物均具有明显抗性。     

高粱甲基化连锁群A、B的构建及甲基化位点、甲基化模式的分析

【目的】构建高粱甲基化连锁群A和B,并分析其上的甲基化位点分布及甲基化模式变化。【方法】从高粱品种强优势组合B2V4×1383-2杂交组合获得的F2分离群体（共150个体）为材料,以SSR标记为锚定标记,采用SSR和MSAP标记技术,并用Mapmaker/Exp（Version 3.0）和Map/Draw 2.1软件进行分析。【结果】构建出高粱甲基化连锁群A-a和A-b及甲基化连锁群B-a和B-b,其中,甲基化连锁群A覆盖高粱基因组93.7 cM,包含10个SSR标记、20个MSAP标记,甲基化连锁群B覆盖高粱基因组90.4 cM,包含4个SSR标记、39个MSAP标记;连锁群A-a上甲基化位点仅来源于EcoRⅠ/MspⅠ酶切组合,而其它连锁群上甲基化位点来源于EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ 2种酶切组合;甲基化连锁群A-b和B-b上各存在一个稍密集的甲基化位点区域,而连锁群B-a上存在一个较密集的甲基化位点区域;基于同一酶切的高粱亲本间有多态性差异,F2群体存在分离,高粱亲本与杂交种F1的甲基化模式有2种类型的变化。【结论】MSAP标记可以检测到大量的甲基化差异片段,结合锚定的SSR标记,能够有效地构建植物基因组的甲基化遗传连锁群或遗传连锁图谱;在连锁群上检测到3个密集的甲基化位点区域,分别位于SSR标记Xtxp 302、Xtxp 96及Xtxp 304附近;在获得的连锁群中,发生去甲基化反应的甲基化位点数高于甲基化水平提高的位点数。     

郑州地区小麦黄矮病病原鉴定及其外壳蛋白的分子进化分析

为了明确郑州地区小麦黄矮病病原种类及其分子变异情况,根据已公布的小麦黄矮病致病毒株GAV,GPV和PAV的外壳蛋白(CP)全长基因序列,采用RT-PCR方法鉴定了来自郑州地区的4个分离物种类,并进行了基于CP序列的郑州分离物与6个国内和3个国外分离物的进化关系分析.结果表明,郑州地区的4个分离物均鉴定为BYDV-PAV(命名为PAV-ZZ),其编码的CP与国内及国外的分离物,在核苷酸水平上的一致性为81%～99%.PAV-ZZ CP与济南分离物一致性最高,核苷酸水平上达99%;与昆明和德国、瑞典、美国分离物一致性较低,核苷酸水平上仅为81%.这表明BYDV-PAV郑州分离物与北方地区的病毒分离物可能有着相似的系统进化特征,而与南方地区及国外分离物在系统进化上有较大的差异.     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析（摘要）

[目的]了解2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,所以均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

[目的]为了解牛病毒性腹泻/黏膜病在新疆的流行现状,对疑似该病病料进行地方毒株的分离,并对其进行鉴定.[方法]将采自新疆不同地区疑似牛病毒性腹泻的病料接种MDBK细胞,并盲传2～4代;对分离株进行毒力测定及中和试验,应用RT-PCR方法扩增分离株的5'UTR基因片段并克隆测序分析.[结果]分离到的8 株病毒可发生细胞病变,在MDBK细胞上的TCID50为103～106.毒株血清中和实验结果,RT-PCR反应结果,克隆后重组质粒经BamH I、Hind III双酶切鉴定、重组质粒PCR鉴定结果均得到预计扩增片段.重组质粒测序结果与GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒NADL株序列同源性为82.0;～94.8;.[结论]证实所分离到的病毒为BVDV,命名为B-S-1、B-S-2、B-S-3、B-S-4、B-S-5、B-S-6、B-G-1和B-G-2.