利用锌指核酸酶(ZFN)技术介导敲除猪卵母细胞孤雌胚胎中肌肉生长抑制素基因(MSTN)的初步研究

肌肉生长抑制素基因(myostatin,MSTN)是转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)超家族的一员,具有特异性调控动物肌肉生长的功能。为证明锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)修饰技术在猪(Sus scrofa)胚胎水平上对MSTN基因修饰的效率,筛选高效的作用靶点,本研究通过构建针对MSTN基因特异位点的ZFN质粒,采用显微注射方法,将其注射进入猪卵母细胞孤雌胚胎细胞,采用PCR对培养后的囊胚进行MSTN基因的扩增检测,并对其进行序列测定比较分析。研究结果表明,373枚注射囊胚基因组经MSTN引物特异性扩增并测序,检测到2枚发生突变,均在ZFN靶位点处,第39号囊胚发生14个碱基的单碱基突变,第321号囊胚发生11个碱基的单碱基突变,ZFN介导的打靶效率为0.54%。本研究进一步验证了ZFN基因编辑技术在敲除猪MSTN基因上应用的可行性,为MSTN基因敲除猪的制备提供了依据。     

反义RNA干扰MSTN对牛肌肉卫星细胞脂肪生成相关基因的影响

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员,在骨骼肌中高表达;敲除MSTN后,肌肉质量增加、脂肪含量变少,但抑制MSTN表达后,如何影响脂肪沉积,尚未研究清楚.为了探究抑制MSTN表达后对脂肪相关基因表达的影响,本研究利用反义RNA技术,成功构建了双向表达载体pMSTN-CMV-CAG-antiMSTN,并通过Western blot筛选出抑制效果最佳的MSTN的反义载体.利用最佳反义MSTN载体在牛(Bos taurus)肌肉卫星细胞中有效干扰MSTN表达后,检测了脂肪合成相关基因(脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN),乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1))、脂肪酸氧化分解相关基因(肉毒碱棕榈酰转移酶ⅠB(carnitine palmitoyltransferase 1b,CPT-ⅠB),乙酰辅酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase,ACOX1)和烯酰辅酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase 1,ECHDC1))以及脂肪转运蛋白(fatty acidtransport proteins,FATP)表达的变化.结果显示,在MSTN基因被干扰后,肌肉卫星细胞中脂肪酸合成相关基因表达量上调,脂肪氧化分解相关基因中ACOX1和CPT-1B表达量上调,而ECHDC1基因表达量下调,另外,FATP表达基本没有变化.MSTN功能缺失后,脂肪合成和脂肪氧化分解过程都得到了加强,所以MSTN敲除所导致的脂肪减少并不是由于抑制了脂肪合成,而是由于脂肪分解加强,为肌肉提供更多的能量.MSTN下调后,CPT-1B的表达上调最为显著,而CPT-1B是脂肪酸β氧化的关键基因,所以研究结果提示MSTN对于脂肪的影响主要是通过影响β氧化过程实现的.研究结果为MSTN下调所导致的脂肪含量下降提供了理论依据,为MSTN作用于脂肪沉积的机制做出了初步探讨.     

猪肌肉生长抑制素(MSTN)前肽定点突变载体的构建及其原核表达

肌肉生长抑制素(MSTN)能够限制肌纤维的增粗增大,而突变的肌肉生长抑制素前肽(Pro-MSTN-D75A)能阻止MSTN与相应受体的结合,从而解除MSTN对肌纤维的抑制作用。猪是我国最重要的肉用家畜,通过操作MSTN提高其瘦肉产量,将对我国生猪生产具有特殊意义。本研究用通城猪妊娠3个月的胚胎为材料,提取背最长肌RNA并以此为模板,用反转录PCR扩增猪MSTN前肽cDNA序列(不含信号肽),并将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上。通过定点突变将编码天冬氨酸的密码子变为丙氨酸密码子(D75A),构建了原核表达载体pGEX-ProM(SP-)和pGEX-ProM(SP-)D75A。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞并经IPTG诱导表达,结果表明,转化pGEX-ProM(SP-)质粒的E.coliBL21工程菌用终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导5h表达情况最好;而转化pGEX-ProM(SP-)D75A的工程菌在1mmol/L的IPTG诱导6h的条件下表达情况最好。用GST-Trap蛋白纯化系统纯化回收总分子量大小约为51kD融合蛋白(GST蛋白标签分子量为26kD,MSTN前肽蛋白分子量为25kD)。纯化蛋白的浓度ProM(-SP)为1.87mg/mL,ProM(-SP)D75A为1.21mg/mL。本研究建立了大肠杆菌表达猪MSTN前肽的最佳条件,提高了生产效率,并为研究MSTN前肽在动物体内的生物学功能以及制备单克隆抗体提供基础资料。     

肌肉生成抑制素和抑制素融合表达质粒的构建和表达

以乙肝表面抗原S基因为载体,分别将肌肉生成抑制素N端基因片段和抑制素N端基因片段分别插入S基因C端和第112～113 氨基酸残基密码子之间,构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pVAX-SMI构建成功。脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞,Western Blot检测表达产物的免疫原性。结果表明,融合目的蛋白成功在HeLa细胞中表达,并具有免疫原性。     

肌肉生长抑制素基因(MSTN)外显子1的多态性及其与边鸡生长性状的关联分析

为了对边鸡生长性状的标记辅助选择提供基础资料,本研究采用PCR-SSCP技术检测边鸡(Gallusgallus)及3个对照鸡(G.gallus)群体(京海黄鸡、尤溪麻鸡和Arbor Acre鸡)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子1的单核苷酸多态性,并与边鸡的生长性状进行相关性分析。结果表明,在边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡中都检测到6种基因型(AA、AB、BB、BC、AC和CC),而在Arbor Acre鸡中只检测到4种基因型(AB、BC、AC和CC)。总共检测到3个多态位点(G2100A、G2109A和C2244G)。在6～8和12周龄时,BB基因型个体的体重显著高于AA基因型个体(P<0.05)。在14周龄时,BB基因型个体的体重显著高于AA和AC基因型个体(P<0.05)。在16～18周龄时,BB基因型个体的体重显著高于其余5种基因型个体(P<0.05)。研究结果提示,MSTN基因可能是影响边鸡生长性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。     

供体细胞和曲古抑菌素(TSA)对奶牛克隆胚胎发育的影响

本研究探讨供核细胞处理策略(新鲜消化、-196℃冻存组(复苏后)和曲古抑菌素(TSA)处理组)和TSA-CR1aa胚胎培养液处理时间对克隆胚发育的影响。利用体细胞核移植技术生产奶牛克隆胚胎,将部分克隆胚移植给自然发情同步的受体,检验克隆胚的体内发育能力。结果显示:TSA处理体细胞组的克隆胚卵裂率和囊胚率与新鲜消化和-196℃冻存组相比差异显著(P<0.05);-196℃冻存组与新鲜消化组差异不显著;用TSA-CR1aa分别处理新鲜消化细胞构建的克隆胚0、24、48和60h,其中,60h处理组的囊胚率最高(36.11±1.78%)与其他组对比差异显著(P<0.05);用TSA-CR1aa分别处理TSA处理组构建的重构胚24、48和60h,结果发现,60hTSA-CR1aa处理组囊胚率(37.39±1.78%)最高,显著高于24h(25.48±1.34%)TSA-CR1aa处理组,且差异显著(P<0.05)。将所获得的克隆胚胎分别移植给40头自然发情的受体母牛,并观察移植25,45,65和90d后的返情情况,结果显示,各组受孕率无统计学差异,但经TSA处理细胞和胚胎组移植的受体中,获得一头存活的体细胞克隆奶牛。说...     

建鲤生长抑制素基因(MSTN)的分离、表达及多态性与体型、平均日增重相关性研究

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是近年来发现的肌肉生长负调控因子,属转化生长因子p(transforming growth factor-β,TGF-β)家族.本实验使用PCR方法从建鲤(Cyprinus carpio var.jian)基因组分离到4个jlMSTNs基因,4个基因具有相同的基因结构,同源性分析表明,两两分属于鱼类MSTN1和MSTN2,分别命名为jlMSTN1a、jlMSTN1b、jlMSTN2a和jlMSTN2b.jlMSTN1s和jlMSTN2s的两旁基因阅读框碱基相似性很高,分别为96%和94%,但内含子存在着长度和序列差异,jlMSTN2a两内含子明显比jlMSTN2b长,分别为1 384、1 763 bp和879、835 bp.jlMSTNs在不同组织的表达量以及各基因上SNP位点数表明,jlMSTN1s所受的选择压力高于jlMSTN2s;jlMSTN2a所受的选择压力大于jlMSTN2b.本实验还筛选到与建鲤体型和平均日增重相关的SNP位点各1个,可作为辅助育种标记.     

山羊生长激素释放激素(GHRH)和抑制素βA(INHβA)基因多态性

用PCR-SSCP和测序技术研究了波尔山羊(Capra hircus)和徐淮白山羊(C.hircus)2个群体共147个个体生长激素释放激素(GHRH)和抑制素βA(INHβA)基因座位的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),结果表明,GHRH基因在第4411处(按GenBank登录号AF242855)丢失了一个碱基G,在2个山羊群体检测到3种基因型(AA、AB和BB);NHβA基因在第995处(按GenBank登录号U16239)丢失了一个碱基T,在2个山羊群体检测到2种基因型(AA和AB),没有检测到BB型个体。这2个位点的突变属首次在山羊中发现,并且均以A等位基因为优势等位基因。同时,计算了2个基因座的杂合度(H)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)和固定指数(F)。结果显示,在2个山羊群体中,2个基因座均符合Hardy-Weinberg平衡。     

茶树脱水素基因(CsDHN)的克隆及表达分析

脱水素(dehydrins,DHNs)是植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)中的一类,与低温、干旱以及盐胁迫等多种逆境反应相关.本研究采用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cDNA ends,RACE)技术从茶树(Camellia sinensis)中获得一种茶树脱水素基因CsDHN (GenBank登录号:FJ436978),序列分析显示,该基因cDNA全长960 bp,编码201个氨基酸,推测编码蛋白质分子量约为21kD,等电点为8.3,属于Y3SK2型脱水素.CsDHN基因有2个外显子和1个内含子.生物信息学预测显示,该脱水素蛋白亲水性强、无信号肽和跨膜区,亚细胞定位于细胞质中.表达特性分析表明,CsDHN在逆境及脱落酸(abscisic acid,ABA)诱导下可上调其转录水平,4℃低温处理下表达量可提高4.2倍,而脱水处理能提高93.4倍,高盐处理能提高17.8倍,CsDHN对脱水、高盐胁迫的响应程度优于低温胁迫.CsDHN在茶树各组织器官中都有表达,其中种子中表达量最高,为叶片的11.2倍.研究表明脱水素基因CsDHN可能在茶树防御非生物逆境胁迫和参与茶树种子成熟脱水的活力保护过程起一定作用,为了解茶树抗逆分子机制提供了一定的理论基础.     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A对东北野猪核移植胚发育的影响

体细胞克隆的效率一直较低,这可能与成熟前卵母细胞的质量有关。猪卵母细胞主要来源于屠宰场的废弃卵巢,这暗示,卵母细胞可能处于发情周期的各个阶段。因此,体细胞核转移之前有必要筛选优质卵母细胞。本研究旨在探讨亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A(TSA)对东北野猪(Sus scrofa ussuricus)核移植胚发育的影响。卵丘卵母细胞复合体经亮甲酚蓝(BCB)染色后分三组:BCB+组(胞质着色,葡萄糖-6-磷酸脱氧酶(G6PDH)活性低)、BCB-组(胞质未着色,G6PDH活性高)和对照组(不使用亮甲酚蓝染色)。卵母细胞体外成熟培养后,对卵母细胞进行核移植操作,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚使用50nmol/LTSA处理,未使用TSA处理的来源于BCB+卵母细胞的核移植胚作为对照组。结果表明,BCB+卵母细胞的直径显著大于BCB-组(P<0.05)。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的初次卵裂时间要早于BCB-组及对照组。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的囊胚形成率显著高于BCB-组及对照组(P<0.05)。且50nmol/LTSA处理可将来源于BCB+卵母细胞的核移植囊胚率提高到(29.6±2.8)%(P<0.05)。总之,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚发育能力较强,且50nmol/L的TSA可促进重构胚的体外发育。对卵母细胞进行BCB染色筛选并使用50nmol/L的TSA处理重构胚,可提高东北野猪核移植重构胚的发育能力,为通过体细胞克隆法保护东北野猪资源创造条件。     

谷子MDH基因非生物逆境响应特性研究

为揭示谷子MDH基因对逆境胁迫的响应,本研究通过序列比对得到2个谷子苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因SiMDH1、SiMDH2,并对SiMDH1和SiMDH2的编码蛋白特征、基因结构、功能、进化等性状进行了系统的分析和预测,用荧光实时定量PCR(qPCR)检测了SiMDH1和SiMDH2在苗期不同逆境及关键生育期干旱胁迫和不同光照强度下的表达。蛋白特征参数和序列分析表明,SiMDH1和SiMDH2蛋白特征参数相似度很高,序列非常保守,都含有MDH基因的特征功能域苹果酸酶NAD结合域和苹果酸酶C端功能域。亚细胞定位预测显示,SiMDH1和SiMDH2主要定位于叶绿体、细胞质和线粒体。启动子区域顺式元件分析发现,在SiMDH1和SiMDH2启动子区域含有大量光应答、激素类和其他类应答元件。苗期逆境qPCR表达谱分析发现,SiMDH1和SiMDH2受脱落酸(ABA)、聚乙二醇(PEG)、高盐和低温不同程度诱导,揭示SiMDH1和SiMDH2参与了谷子苗期非生物逆境胁迫应答。进一步分析发现,SiMDH1和SiMDH2参与了谷子在拔节、抽穗、灌浆期的干旱应答,...     

奶山羊ESCO2基因克隆及其功能的初步研究

乙酰基转移酶2 (establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2)主要作用为调控姐妹染色单体的凝聚,在细胞DNA双链断裂损伤修复中发挥着重要的作用.本研究以关中奶山羊(Capra hircus)作为实验材料,利用PCR、qRT-PCR、生物信息学、免疫荧光染色等方法,分析其基因序列以及表达规律,克隆ESCO2基因,同时构建真核表达载体pESCO2-IRES2-AcGFP并转染奶山羊雄性生殖干细胞(mGSCs-I-SB细胞).结果表明,奶山羊ESCO2基因(GenBank登录号:KP341998.1)全长为1 834bp,编码612个氨基酸.与其他物种相比,均具有较高的同源性,与牛(Bos taurus)的同源性高达97.82％.ESCO2基因在奶山羊的多个器官中广泛表达,尤其在心脏、肺部表达较高,肝、脾、睾丸次之.ESCO2基因从山羊出生后开始持续高表达,且表达量随山羊年龄增加而升高,一岁时达到最高,随之开始下降.转染pESCO2-IRES2-AcGFP表达载体的mGSCs-I-SB细胞的减数分裂相关基因表达量明显提高,证明ESCO2基因在奶山羊减数分裂和精子发生过程中发挥了重要的作用.本研究结果为进一步研究奶山羊精原细胞减数分裂的精密调控提供了分子基础.     

有机肥施用对菜地磷素径流流失及磷素表观利用率的影响

采用田间小区定位试验(2011—2012年)研究了自然降雨条件下有机肥施用对太湖流域典型蔬菜地磷素径流流失、蔬菜产量及磷素表观利用率的影响。结果表明:冬瓜种植季内菜地径流水量可达1 800~3 528m~3/hm~2,且与降雨量呈显著线性正相关关系。单施化肥(T1)处理条件下,菜地磷素(TP)径流流失量和流失系数分别达3.45kg/hm~2和1.08%,有机肥施用(T2、T3)显著增加TP径流流失量达14.79%和115.36%,而流失系数却降低39.63%(P0.05)和9.11%(P0.05)。从冬瓜产量角度考量,较T1处理而言,有机肥施用(T2、T3)条件下,虽然经济产量和废弃物产量分别提高1.41%~2.88%和4.17%~6.20%,但冬瓜经济系数却稍有下降,但处理间差异不显著。同时,虽然有机肥施用(T2、T3)显著增加冬瓜磷素吸收量达27.27%和46.18%,但磷素表观利用率却显著降低36.79%和61.22%(P0.05)。有机肥施用显著增加菜地磷素盈余,T2、T3处理条件下,盈余量高达238.44~496.28kg/hm~2,分别达T1处理的2.60倍和5.42倍。     

CD14沉默的猪小肠上皮细胞系的建立及其对大肠杆菌黏附能力的变化分析

白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14,CD14)在先天性免疫和适应性免疫反应中都发挥重要调控作用,本研究旨在构建猪(Sus scrofa)CD14基因的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)干扰载体,包装成慢病毒,转染猪小肠上皮细胞,在细胞水平上进行相关功能探讨.本研究参照CD14基因(GenBank登录号:EF626695.1)全长编码区序列,设计4个靶向猪CD14基因的shRNA干扰序列,将其克隆至慢病毒表达载体质粒中,分别命名为pGLV3-CD14-1、pGLV3-CD14-2、pGLV3-CD14-3和pGLV3-CD14-4,以及阴性对照pGLV3-CD14-NC.包装成功后转染猪小肠上皮细胞系IPEC-J2,利用qRT-PCR检测其干扰效率.选择干扰效率最高的慢病毒进行药筛,获得CD14基因稳定沉默的猪小肠上皮细胞系.大肠杆菌(Escherichia coli)黏附实验检测大肠杆菌F18ab和F18ac对CD14基因沉默小肠上皮细胞黏附能力的变化.结果表明,本研究成功构建4个shRNA表达载体,包装成的慢病毒均能降低猪CD14mRNA表达水平,其中pGLV3-CD14-3慢病毒的干扰效果最好,其干扰效率达到94.6％;CD14基因沉默后F18ab对小肠上皮细胞的黏附能力显著增强,而F18ac虽然也有上调,但并未产生显著性差异.研究结果表明,CD14基因沉默后的小肠上皮细胞对大肠杆菌F18ab的黏附能力显著增强,CD14基因可能在小肠上皮细胞抵御大肠杆菌F18ab感染过程中发挥了重要的调控作用.慢病毒介导的CD14沉默的猪小肠上皮细胞系的建立,不仅为在细胞水平研究CD14基因功能提供了有效模型,也为进一步探究其所在的Toll样受体/白介素-1受体(toll-like receptors/interleukin-1 receptor,TLRs/IL-1 R)信号通路在猪肠道病原微生物引起的免疫反应和抵御病原入侵的调控机制奠定了基础.