大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。     

硫代葡萄糖甙和类黄酮对枯草芽孢杆菌在油菜根部定殖的影响

在植物一微生物一土壤三元关系中，根际微生物作为土壤和植物中介与桥梁，是最为活跃的因素，其活动规律对于土壤肥力、植物营养和植物病害都有举足轻重的作用。植物促生细菌（ Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）在植物的根际普遍存在，应用某些优良菌株促进植物生长的试验也获得了不少好的结果，但这些试验多在人工控制的条件下进行，     

利用简单重复序列(SSR)标记分析太湖稻区现代粳稻品种的遗传多样性

太湖地区有丰富的粳稻(Oryza satiua ssp.japonica)种植资源,随着品种大面积推广应用,育种材料的遗传基础趋窄,相似性增高,使粳稻育种突破困难。本研究利用分布于水稻(Oryza satiua L.)12条染色体上的24对简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)引物对太湖地区的42份粳稻品种进行遗传多样性分析。结果表明,有23对SSR引物在42份粳稻材料间表现出多态性;23对引物共检测到105个等位基因,每对SSR引物检测到等位基因为2~8个,平均为4.57个,有效等位基因共有56.43个,平均每个位点为2.45个。每个多态位点的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)变幅为0.083 0~0.8079,平均为0.496 6;每个粳稻材料多态性位点数的变幅为6~19,等位基因总数的变幅为27~55;42份粳稻品种间的遗传相似系数变幅为0.391~0.990,平均为0.610,遗传相似系数在0.50~0.80之间的材料占全部的74.45%,供试材料相似度高;非加权配对算术平均法(unweighed pair group method with arithmetic mean;UPGMA)聚类结果显示,遗传相似系数为0.50,42份粳稻材料可以分为两个类群,一个类群包含19份常规粳稻,另一个类群包括其他23份杂交粳稻。结果显示,太湖地区的粳稻品种总体上遗传背景相似度高,遗传多样性不够丰富,育种工作有待进一步加强新的基因资源引进和利用,创新水稻育种材料。本研究结果为新品种选育提供技术支持和理论根据。     

与大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记开发

分子标记辅助选择可大大加快育种进程,然而由于大白菜抗病毒病遗传规律的复杂性,目前所定位的基因和筛选的连锁标记远不能满足育种需要,为了更好地对抗病毒病白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)进行分子标记辅助选择,本研究筛选了与大白菜抗芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记.本研究在对该基因进行定位的基础上,利用回交1代(backcross1,BC1)分离群体,采用分离群体分组分析法(bulked segregation analysis,BSA)、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)和序列特异引物(sequence specific primer,SSP)标记技术,筛选与该基因紧密连锁的分子标记.通过对13对SSP引物和16对SSR引物的分析表明,有8对引物在两亲本间表现多态性,有5对引物扩增出的标记与基因TuRBCS01紧密连锁或共分离,分别为mBr4072、Bra025493-1、Bra025493-2、Bra025467-4和Bra025467-5.筛选出与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记2个,分别为SAAS_mBr4072_240 (1.5 cM)和Bra025493-1(1.0 cM),另有3个标记与基因TuRBCS01共分离,分别为SAAS—Bra025493-2_749、SAAS_ Bra025467-4—780和SAAS—Bra025467-5_ 956.上述标记丰富了大白菜抗TuMV分子标记的数量和种类,有望用于大白菜抗病毒病分子标记辅助选择.     

金针菇种质资源5个农艺性状与SSR标记的关联分析

金针菇(Flammulina velutipes)是一种重要的商业化栽培食用菌,为挖掘控制金针菇重要农艺性状的基因组区段,本研究以90份金针菇种质资源为实验材料,测定其原基期、菌柄直径、菌柄长度、菌盖直径和单瓶产量5个农艺性状,利用全基因组序列开发的95份多态简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记对供试材料进行基因组扫描,在分析实验材料的群体结构和连锁不平衡基础上,采用一般线性模型方法对5个农艺性状进行关联分析。结果表明,各供试材料的5个农艺性状均有极显著差异。95份多态SSR标记共检测到582个等位变异,平均每个位点的等位变异数为6.13个。标记多态信息含量(polymorphism information content,PIC)变化范围为0.204~0.818,平均为0.542。群体遗传结构分析将供试材料分为8个亚群体,群体内SSR位点间存在较高的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD),不平衡程度D’值大于0.5的组合数占总组合数的33.01%。关联分析检测出28个标记与5个性状显著相关,其中原基期的关联标记有2个,菌柄直径的关联标记有12个,菌柄长度的关联标记有3个,菌盖直径的关联标记有9个,单瓶产量的关联标记有5个。关联SSR标记对表型变异解释率的变幅为5.11%~23.55%。研究表明,所选金针菇种质资源群体的遗传多样性以及连锁不平衡程度较高,适用于关联分析研究。本研究结果对金针菇核心种质资源库构建以及分子标记辅助育种具有参考价值。     

大蒜种质遗传多样性的SSR分析

为了探索中国大蒜种质个体的SSR位点的分布情况,为品种鉴定、保存及遗传改良提供分子生物学依据,利用6对SSR引物对40个大蒜(Allium sativumL.)品种进行聚类分析、主成分分析及遗传多样性评价。共检测到21个多态性位点,平均每对引物可扩增出约3.5条多态性片段,多态性百分率为56.76%;SSR引物组合平均有效等位基因数、Nei基因多样度和Shannon信息指数分别为1.5551、0.3414和0.5188。聚类分析显示,6对SSR引物可把40份大蒜种质资源从0.59相似系数水平上3个类群。第一类群包含28份种质,在相似系数为0.73的水平上进一步又被分成了3个亚类;第二亚类仅包含2份种质;第三亚类包含10份种质,在0.68的相似系数水平上分成了2个亚类。主成分分析和UPGMA的结果基本一致。不同地理来源的大蒜种质的Shannon-Weaver多样性指数的变幅为0.0576~0.4179,说明大蒜种质遗传多样性丰富。本研究利用SSR分子标记技术较准确地解析大蒜不同材料间的亲缘关系及遗传多样性,为中国大蒜SSR分子标记提供基础资料。     

利用核心简单重复序列(SSR)标记分析西洋梨品种资源遗传多样性

由于梨(Pyrus)本身的自交不亲和特性导致不同地区品种间基因存在较大差异。为鉴定品种资源的多样性,探索重要的遗传特性,本研究利用覆盖梨全基因组17个连锁群中的134个核心简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记对45份西洋梨(Pyrus communis L.)品种资源进行遗传多样性和群体结构分析,对不同来源的SSR标记进行多态性分析。结果表明,来自梨基因组的SSR标记多态性更高,更适合梨的遗传多样性研究;所有SSR引物共检测到673个等位基因,每个SSR位点平均扩增5.02个;45份西洋梨品种的观测等位基因数(observed number of alleles,Na)、有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)以及Shannon信息指数(Shannon’s information index,I)平均值分别为5.02、3.84、0.73、0.72和1.42;遗传相似系数和聚类分析结果表明,45份西洋梨具有较高的遗传多样性,且品种的演化趋势较均匀,欧洲和美洲的品种没有因地理位置不同而产生太大差异,而是不同来源地的品种相互交织在一起,更加体现了西洋梨之间广泛的基因交流;同时推测未知来源地的库介梨、费莱茵和地里拜瑞可能来源于西欧地区;群体结构分析表明,当K=2时,西洋梨分为Pop1和Pop2两大类群,利布林、波12、拉达那、地里拜瑞、红安久和孔德梨体现了较高的杂合性;不同品种的指纹图谱分析结果表明,至少需要两个以上的引物组合才能够将不同品种区分开。研究结果为全面评价西洋梨的遗传背景和特征、准确鉴定不同品种资源提供了科学依据和高效标记,为今后西洋梨种质资源的保护利用以及遗传育种提供基础资料。     

喷施蔗糖和葡萄糖对小白菜硫代葡萄糖苷含量的影响

以小白菜"上海青"为试验材料,研究了喷施蔗糖和葡萄糖对小白菜生长和硫代葡萄糖苷含量的影响。结果显示,蔗糖和葡萄糖喷施对小白菜地上部鲜重和干重均没有显著影响,喷施蔗糖均能够显著增加小白菜总脂肪族硫代葡萄糖苷、总吲哚族硫代葡萄糖苷和总硫代葡萄糖苷含量,其中,0.1mol/L蔗糖喷施显著提高了3-丁烯基硫代葡萄糖苷和吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷含量,0.2mol/L蔗糖喷施显著增加了吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷和4-甲氧基吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷含量。0.2mol/L葡萄糖喷施显著增加总硫代葡萄糖苷及单个硫代葡萄糖苷含量。蔗糖和葡萄糖喷施均有增加总吲哚族硫代葡萄糖苷相对百分含量的趋势。研究表明外源喷施糖对小白菜硫代葡萄糖苷含量和组成具有显著的影响。     

小麦抗叶锈病基因Lr2c的SSR标记

选取抗叶锈病基因位于2D染色体上的TcLr2c等7个小麦（Triticum aestivum）近等基因系、感病亲本Thatcher及215株TcLr2c与Thatcher杂交F2代为材料,研究抗叶锈病基因Lr2c SSR分子标记。从筛选的29对位于小麦2D染色体的SSR引物中获得4对能够揭示Lr2c多态性的分子标记,通过215株TcLr2c × Thatcher F2群体验证,结果表明Xgwm261和Xgwm296与Lr2c紧密连锁,其距目的基因的遗传距离分别为1.9和3.6 cM,可用于小麦抗叶锈病分子辅助育种。     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

大白菜抽薹相关基因BrFLC1的KASP标记开发

为了提高大白菜耐抽薹品种的分子育种效率,本研究针对大白菜抽薹相关基因BrFLC1第6个内含子的第一个碱基(Pi6+1)G-A的SNP变异开发进行高通量检测的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。结果表明,开发的KASP标记BrFLC1-KASP1可有效将晚抽薹类型材料Y177-12(G)和早抽薹类型材料Y195-93(A)分为2组。利用BrFLC1-KASP1标记可以对57份大白菜材料的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与酶切扩增多态性标记(CAPS)G-MvaI以及直接测序法的鉴定结果完全一致。综上所述, BrFLC1-KASP1标记在大白菜材料中具有通用性,且具有准确率高、成本低、效率高的特点。本研究结果对大白菜耐抽薹性的分子标记辅助选择具有重要的育种实践价值。     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.     

钼对小白菜抗坏血酸氧化还原的影响

采用盆栽试验研究了钼对小白菜抗坏血酸含量、氧化还原状态及相关酶活性的影响。结果表明,各施钼水平均提高了小白菜产量、抗坏血酸总量以及还原型抗坏血酸（ASC）含量。随着施钼水平的提高,抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性均呈上升的趋势;抗坏血酸氧化酶（AAO）活性逐渐下降。表明施用钼肥能够促进小白菜抗坏血酸氧化还原及再生循环过程,从而提高了抗坏血酸的含量。     

大白菜-结球甘蓝AT4系列易位系抽薹相关基因的表达分析

未熟抽薹会对大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)生产造成重大损失.为研究大白菜抽薹开花相关基因,本研究对添加结球甘蓝(B.oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜耐抽薹和易抽薹易位系间存在差异的cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)条带进行回收测序,其差异条带的同源性比对和功能性分析结果表明,差异基因可分为3种:转录翻译类、信号传导类和膜运输类.其功能预测涉及细胞物质运输、信号转导、物质能量代谢、胁迫应答、基因表达调控、细胞周期等.对其中8条序列进行qRT-PCR检测结果表明,在春化处理过程中P65M58-11、P65M58-12和P75M47-9在极晚抽薹材料中表达量峰值极显著高于极早抽薹材料,P65M58-11和P65M58-12条带的表达量峰值出现在春化处理14d时.而P75M47-9在极晚抽薹材料中表达量峰值出现在春化处理7d,在极早抽薹材料中从春化处理开始就呈现出下调趋势;P77M58-9、P77M58-12、P63M49-8-1和P63M61-4-2在极晚抽薹材料中表达量峰值极显著低于极早抽薹材料,P63M49-8-1在极早抽薹材料中表达量的峰值出现在春化处理7d,而在极晚抽薹材料中从春化处理7d后表达量逐渐上调.P77M58-9、P77M58-12和P63M61-4-2表达量峰值出现在春化处理14d时;另外P63M49-1-2条带在极晚抽薹和极早抽薹两种材料中表达量差异无明显规律,在极早抽薹材料中表达量峰值出现在春化处理7d时,而在极晚抽薹材料中峰值出现在春化处理21d时.本研究获得了在6个易位系、2个自交系、2个商品种的耐抽薹和易抽薹材料间表达量及表达模式存在差异的8个基因,为深入挖掘大白菜抽薹开花相关基因、开展基因功能验证以及获得耐抽薹大白菜材料提供基础资料.