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为分离与鸡抗病性密切相关的差异表达基因,并进行功能分析,利用抑制性消减杂交技术,以大骨鸡和海兰褐商品代蛋鸡20周龄时的脾脏组织为试验材料构建消减cDNA文库。文库的插入片段集中在600 bp左右,挑取760个克隆进行PCR筛选获得663个阳性克隆,经过点杂交筛选后选择了531个阳性克隆,从中随机挑取100个阳性克隆进行测序。经过同源性比对归并后得到37个差异表达基因或ESTs序列,其中,32个是已知基因,包括一般抗病性或免疫性能、特异抗病相关基因、细胞信号分子、膜蛋白质、转录因子等差异表达基因;5个为功能尚未确定的基因。并对4个可能影响鸡抗病性能的差异表达基因进行了RT-PCR半定量检测鉴定。该试验结果为进一步研究这些差异表达基因在抗病过程中的重要功能及其调控作用机理奠定了基础。 相似文献
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差异表达基因克隆技术的研究进展 总被引:4,自引:0,他引:4
随着基因组计划的顺利实施,大量的生物信息被解析,分离并克隆差异表达基因已成为生命科学研究的热点.近些年来,国内外学者发展了多种分析差异表达基因的技术.现就目前主要使用的一些技术作一综述. 相似文献
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构建旋毛虫新生幼虫cDNA文库并对旋毛虫新牛幼虫期特异件基因进行筛选与鉴定,筛选出期特异性的基因片段.用λZAPⅡExpress载体成功地构建了旋毛虫新生幼虫的cDNA文库,并用放射性同位素a-38P标记cDNA探针对筛选出的阳性克隆进行鉴定.所构建的cDNA文库容量为1.92×106,重组效率为98.6%,所有的克隆片段都在0.5~2.0 kb之间,筛选获得7个阳性克隆,其大小在1.4 kb左右;用放射性同位素a-32P标记cDNA探针后,与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼虫及成虫/新生幼虫cDNA文库质粒DNA进行Southern印迹杂交,结果与新生幼虫和成虫、新生幼虫cDNA文库质粒DNA有杂交而与成虫、肌幼虫cDNA文库质粒DNA不杂交.该基因是新生幼虫期所特有的cDNA片段. 相似文献
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为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。 相似文献
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尽管以λ噬菌体载体系统构建的cDNA文库具有装载容量大、质量高、代表性好、适合长期保存等优点,但是噬菌斑铺平板培养不但工作量大、费时费力,而且效率很低.此外,以λ噬菌体载体系统构建的cDNA文库可采用的筛选方法有限,不能对文库进行功能性筛选.根据λTriplEx2噬菌体能利用重组酶自身环化成质粒pTriplEx2这一原理,通过随机挑选多个分界良好的噬菌斑转导入E.coli BM25.8菌中将噬菌体转化为质粒的实验,说明是一种实现cDNA文库功能性筛选简单而有效的方法,打破了噬菌体文库筛选方法的局限性,在功能基因组学研究方面具有广阔的应用前景. 相似文献
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尽管以λ噬菌体载体系统构建的cDNA文库具有装载容量大、质量高、代表性好、适合长期保存等优点,但是噬菌斑铺平板培养不但工作量大、费时费力,而且效率很低。此外,以λ噬菌体载体系统构建的cDNA文库可采用的筛选方法有限,不能对文库进行功能性筛选。根据λTriplEx2噬菌体能利用重组酶自身环化成质粒pTriplEx2这一原理,通过随机挑选多个分界良好的噬菌斑转导入E.coli BM25.8菌中将噬菌体转化为质粒的实验,说明是一种实现cDNA文库功能性筛选简单而有效的方法,打破了噬菌体文库筛选方法的局限性,在功能基因组学研究方面具有广阔的应用前景。 相似文献
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《经济动物学报》2022,(2)
为获得梅花鹿生肌调节因子(Myf5)基因编码区序列(CDS),并探讨该基因在雌雄梅花鹿及其不同部位的肌组织间差异表达情况,以成年健康雌雄梅花鹿心肌、背最长肌、股四头肌、臀大肌、肋间肌组织为试验材料,以臀大肌组织cDNA为模板克隆获得Myf5基因CDS,运用生物信息学软件进行测序及分析,并利用实时荧光定量PCR技术检测Myf5基因在不同部位的肌组织间相对表达量。结果表明:克隆得到的梅花鹿Myf5基因CDS全长为768 bp;与GenBank上公布的家牛(Gene ID:281335)Myf5基因CDS的同源性为99.61%;梅花鹿与家牛的遗传距离最近,聚为同一支;梅花鹿Myf5蛋白氨基酸组成中丝氨酸含量最高,占氨基酸总量的13.3%;Myf5蛋白具有较强的亲水性,其蛋白二级结构包含α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-折叠;荧光定量结果分析表明,梅花鹿Myf5基因在雌、雄梅花鹿及其不同部位的肌组织间均有差异性表达。 相似文献
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差异表达基因筛选技术是研究生物重要经济性状相关基因或抗病相关基因的有力工具。作者总结了近年来发展起来的几种高通量筛选差异表达基因的技术,并对其原理、流程及在家畜中的应用作了简要介绍。 相似文献
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本试验采用抑制性消减杂交技术构建了卵泡期第4天梅山猪和杜洛克猪中等卵泡M2组织差异表达的消减cDNA文库,从中筛选差异表达的基因,并通过实时荧光定量PCR对其进行验证,利用DAVID软件对差异表达的基因进行聚类分析。结果表明,从梅山猪和杜洛克猪M2卵泡消减文库中筛选得到了148和75个差异表达的ESTs,分别含有125和60个已知的基因。实时荧光定量PCR验证结果与筛选结果相符。GO功能分类注释到调控代谢、细胞循环、生物合成、胞内转运、类固醇雌激素受体和刺激等生物学过程。KEGG Pathway分析表明有6个基因参与TGF-beta信号通路,5个基因参与卵母细胞减数分裂信号通路,7个基因参与类固醇雌激素受体信号通路,推测TGF-beta信号通路中的基因可能调控猪卵泡的发育。研究结果为深入探讨卵泡发育机理和对繁殖性状影响的遗传机理奠定了基础。 相似文献
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ZHAO Zhi-chao HUANG Tao YANG Fei LIU Li-juan SUN Jing-li WANG Xiao-yan SONG Cheng-yi LI Da-quan 《中国畜牧兽医》2017,44(2):505-513
To reveal the molecular mechanism involved in different number of ovulation between hyperprolific and ordinary sows, forward and reverse subtracted cDNA libraries were constructed to screen differentially expressed genes in medium ovarian follicles at 4th day during follicular phase of estrous cycle between Meishan and Duroc sows. The differentially expressed genes selected were demonstrated by Real-time PCR and cluster analysis was performed through DAVID. The results showed that a total of 148 and 75 non-redundant ESTs were isolated from the SSH library of Meishan and Duroc sows M2 follicles, including 125 and 60 known genes, respectively. The results of Real-time PCR were consistent with the screening results. GO analysis indicated that these genes were involved in regulation of metabolic process, cell cycle, biosynthetic process, intracellular transport, steroid hormone receptor and stimulus. KEGG pathway analysis defined 6 genes involved in TGF-beta signaling pathway, 5 genes in oocyte meiosis pathway, 7 genes in steroid hormone receptor signaling pathway. Genes controlling TGF-beta signaling pathway were considered to play an important role in regulating follicle development. The research would be helpful for further studying the follicular development and the genetic mechanism on reproductive traits. 相似文献
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旨在通过转录组测序技术获得简州大耳羊肌内前体脂肪细胞成脂分化前后的差异表达基因,并经生物信息学分析获得相关信号通路及可能发挥作用的关键功能候选基因。本研究以7日龄的健康简州大耳羊公羊为试验动物(n=3),采用胶原酶消化法分离获得其肌内前体脂肪细胞;利用Illumina平台对肌内前体脂肪细胞和诱导分化5 d的肌内脂肪细胞cDNA样品(n=3)进行高通量测序;以|log2fold change|>0和P<0.05为阈值筛选获得差异表达基因,并利用clusterProfiler R包对其进行GO功能和KEGG通路富集;最后利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测功能候选基因在细胞分化前后的表达量变化。结果显示,共获得差异表达基因7 916个,其中4 143个为表达上调基因,主要富集到氧化磷酸化、核糖体合成和三羧酸循环通路等305条通路;3 773个为表达下调基因,且主要富集到甲状腺激素信号通路等303条通路;差异基因GO功能注释中52.8%为生物过程、13.4%是细胞组成和33.8%是分子功能。qRT-PCR结果表明,UCP3、ACACB、ACOT11、ACOX3、APOA1和WISP2在分化前后的山羊肌内脂肪细胞中的表达趋势与RNA-seq结果一致,提示这些基因适合作为下一步研究的功能候选基因。本研究筛选得到简州大耳羊肌内脂肪细胞成脂分化的差异基因,并确认了6个基因可作为功能候选基因。研究结果为阐明肉用山羊肌内脂肪细胞成脂分化的分子调控网络提供基础数据和系统资料。 相似文献
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旨在基于RNA-Seq技术对塔里木马鹿毛色相关基因进行筛选及分析。采用Illumina Hi Seq TM2000测序平台对塔里木马鹿和天山马鹿的皮肤组织进行转录组测序,所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、COG、KOG、KEGG、GO和Pfam数据库中注释,并对差异表达基因进行筛选、功能注释和富集分析。结果表明,测序获得25 038个有注释信息的Unigenes,比对分析显示,塔里木马鹿与天山马鹿有922个差异表达基因,其中上调表达基因495个,下调表达基因427个;GO功能富集分析结果显示,568个差异表达基因富集到61个GO条目上,分别参与了生物学过程、细胞组分及分子功能;KEGG代谢通路富集分析发现,在差异表达基因中富集最显著的代谢通路是ECM-受体相互作用。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析与塔里木马鹿毛色相关的7个候选基因的转录水平变化来验证转录组测序结果的准确性和可靠性,这些基因的表达趋势与转录组测序结果相一致。ECM-受体相互作用、蛋白质消化与吸收、PI3K-Akt信号通路及与黑色素合成相关的酪氨酸等通路可能与塔里木马鹿的毛色有关;候选基因MITF、Ggt1、VDR、PTPRF、CⅡTA、ARPC5L、POMC等可能在塔里木马鹿毛色形成过程中发挥重要作用。本研究结果为今后塔里木马鹿毛色相关基因的分子调控机制方面及挖掘潜在的新基因提供了丰富的试验数据。 相似文献