强优势玉米杂交种雌穗均一化cDNA文库的构建与鉴定

以强优势玉米杂交种豫玉22发育时期的雌穗为材料构建cDNA文库,为进一步研究和分离杂种优势相关基因构建技术平台。选择玉米雌穗发育过程中的4个时期(生长锥伸长、小穗分化、小花分化和花丝始伸期)的雌穗组织分别构建了4个定向cDNA文库,依据基因组DNA饱和杂交的原理,将从4个独立的cDNA文库中提取的质粒混合,通过基因组DNA亲和体系饱和杂交,获得雌穗全发育时期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.3kb,含有3×104个克隆。对文库中随机的150个克隆进行测序,81.6%的序列为非冗余序列,11.2%的序列含有两个或两个以上的拷贝,并且主要来自多基因家族转录本,说明此文库的均一化有效。对测序结果进行功能聚类分析,发现文库序列涉及水解酶、转移酶、核苷酸结合蛋白、蛋白激酶、转录因子等基因,涉及环境应答、蛋白代谢、物质转运、个体发育等多个生化途径,说明该均一化文库基因覆盖度较高。该文库还包含有大量的未知基因,有待进一步的发掘和研究。     

香蕉果实cDNA文库的构建

将从处于一定成熟度的香蕉果肉中纯化出的mRNA反转录成cDNA。cDNA纯化后与EcoRI转接头相连,并插入λgt10载体,经体外包装,侵染大肠杆菌C600hfl菌株,从而构建了香蕉果实的cDNA文库。     

苎麻茎皮cDNA文库的构建

以生长中期的苎麻茎皮为材料,提取总RNA,经纯化mRNA后,合成双链cDNA。双链cDNA加上EcoRI-SmaI接头后,用限制酶NotI酶切并除去小于400bp的短链cDNA,长的cDNA片段连接到EcoRI-NotI酶切载体pAP3neo上,获得滴度为2.6×104的苎麻cDNA文库,插入片段大部分分布在500bp～1500bp之间。该文库的建立为苎麻表皮功能性新基因的发现奠定了基础。     

苎麻茎皮cDNA文库的构建

以生长中期的苎麻茎皮为材料，提取总RNA，经纯化mRNA后，合成双链cDNA。双链cDNA加上EcoRI—SmaI接头后，用限制酶NotI酶切并除去小于400bp的短链cDNA，长的cDNA片段连接到EcoRI—NotI酶切载体pAP3neo上，获得滴度为2．6×10^4的苎麻cDNA文库，插入片段大部分分布在500bp-1500bp之间。该文库的建立为苎麻表皮功能性新基因的发现奠定了基础。     

木奈褐变果实均一化全长cDNA文库的构建及部分ESTs序列分析

以发生褐变初期的(木奈)果肉总RNA为材料,对SMARTTM cDNA合成方法进行改良,并将长距离PCR、DSN处理和定向克隆相结合,成功构建(木奈)褐变果实均一化全长cDNA文库.经检测,该文库的初始滴度为2.0×106 pfu/mL,重组率为99％,插入片段大小平均为1.8 kb,文库质量良好.随机挑取720个阳性克隆进行5'EST测序,共获得684条有效的ESTs序列;并将684条有效序列拼接后,58条被组装成21个重叠群(contigs),单拷贝(singlets)基因有626条,共得到647个单基因簇(unigenes),文库冗余率为8.4％.用Blast 2 go在线软件对测序结果进行功能注释和归类分析,结果显示,已知功能基因与能量代谢、蛋白质合成与降解、次生代谢物质、细胞壁代谢和转录因子有关.该文库的构建有利于从分子水平上研究(木奈)果实褐变发生的机制.     

小粒野生稻酵母双杂交cDNA文库的构建

采用酵母双杂交系统,利用SMART技术,在酵母菌株AH109中构建了小粒野生稻全长cDNA文库,文库容量约为1×106,插入片段平均大小约为640bp。该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选。     

花生种子全长cDNA文库的构建和鉴定

以花生品种闽花5号各发育时期的种子为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA。利用限制性内切酶SfiⅠ酶切。将经过分级分离得到的cDNA连接到质粒载体pDNR-LIB,成功构建花生种子全长cDNA文库。将所得到初级文库扩增后进行保存,检测扩增文库滴度为1.7×109cfu/mL。PCR鉴定重组子,发现重组率接近100%,插入片段集中分布在0.5~2.0 kb。插入片段的平均大小在1000 bp左右,这说明该文库既可以满足低丰度基因的筛选,也可保证获得全长cDNA。     

花生蛴螬中肠组织cDNA文库的构建

利用Qiagen试剂盒提取花生害虫华北大黑鳃金龟幼虫蛴螬中肠总RNA,并纯化mRNA,然后按照Stratagene试剂盒合成双链cDNA,经过凝胶柱层析,收集符合要求的cDNA片段,加工后与Uni-ZAP XR Vector连接,经Gigapack Ⅲ Gold体外包装,即获得蛴螬的cDNA文库,未扩增文库滴度1.95×106pfu/mL,重组率为99.7%,扩增后文库滴度达1.34×109pfu/mL,插入cDNA片段的长度平均为1.34kb,表明成功构建了高质量的蛴螬中肠cDNA文库。     

长雄野生稻地下茎cDNA文库的构建及EST分析

长雄野生稻(Oryza longisatminata)是广泛生长在热带非洲的1个野生种,具有明显的地下茎特征.为了探索控制其地下茎发育的相关基因及其他优异基因,初步构建了地下茎cDNA文库.文库指标显示:初始滴度为2.5×105cfu/μg,扩增滴度为2.9x108cfu/μg,库容为5x106cfu,重组率为82%;随机挑选80个单克隆进行测序,插入片段在400～1 000bp之间;对测序结果进行比对分析,获得了58个已报道有一定功能的EST序列,22个未见报道的EST序列;并利用PAUP4.0软件对序列进行了筛选分析.     

巴西橡胶树胶乳均一化cDNA酵母表达文库的构建

利用DSN(duplex-specific nuclease)技术构建胶乳均一化cDNA酵母表达文库,为大规模文库筛选实验和发掘重要的低丰度表达基因,以及研究橡胶树胶乳中蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系奠定基础。     

外源ABA对冬小麦叶片抗寒相关蛋白的影响

为了解外源ABA对冬小麦抗寒性的蛋白质组学影响机制,以强抗寒品种东农冬麦1号和弱抗寒品种济麦22为材料,苗期经外源ABA和钨酸钠(ABA合成抑制剂)处理后,分别于18℃、4℃、-6℃和-20℃进行低温胁迫,对小麦叶片的全蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,低温下,外源ABA诱导处理后,东农冬麦1号叶片产生23、35和51kD特异蛋白,15、43及53kD蛋白上调表达;济麦22叶片产生28和36kD特异蛋白,15、53及76kD蛋白上调表达。     

利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库

Oligo-Capping法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一.笔者在引进、消化和吸收的基础上,通过对特异引物和接头序列的设计,及cDNA扩增反应条件的优化,对该方法进行了一些切实可行的改进,形成了一套简便易行的技术体系.利用本研究中改进的Oligo-Capping法,成功地构建了甘蔗茎全长cDNA文库.综合评价结果表明,本研究中所构建的甘蔗茎全长cDNA文库的库容大于2.5x106cfu,重组率为91%,全长率高达88.9%.本文库的构建为进一步甘蔗茎中全长基因的克隆和功能基因的表达分析奠定了基础.     

人参叶cDNA文库构建中的问题与对策

人参是传统中药的典型代表且具有很高的药用价值。作为一种广泛种植的中药材，它的次生代谢产物种类多，但目前关于人参有效成分如人参皂苷的生物合成途径及其调控的基础研究相对缺乏。本文以人参叶组织为材料，总结了构建人参叶cDNA文库过程中存在的一些关键问题和应采取的对策，为今后人参和其它药用植物的RNA提取、构建高质量的cDNA文库来保存珍贵基因资源、克隆和研究与有效成分合成相关的基因及EST文库等。提供技术参考和理论指导。