白粉病菌侵染条件下小麦酵母双杂交文库的构建及可用性检测

为解析白粉病菌侵染小麦以及小麦防御的分子机制,以抗白粉病种质N9134为材料,剪取白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)接种48 h后的叶片,提取总RNA,利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA(ds-cDNA),并进行均一化处理和SfiI酶切处理,处理后的ds-cDNA分别连接pGADT7-SfiI三框载体,将连接产物转化至感受态细胞HST08中构建文库。通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集细菌并提取质粒。经鉴定,该文库库容量大于1.0×10~6 cfu·mL~(-1),插入片段主要分布在400～2 000 bp之间,重组率为100%,冗余度为3%。利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,获得2个与热休克蛋白HSP40-70互作的蛋白质,分别为DnaJ类蛋白(DnaJ-like)和E3泛素蛋白连接酶AIP2(AIP)。综上表明,文库构建质量较好,为后续筛选抗逆关键基因奠定了基础。     

小粒野生稻酵母双杂交cDNA文库的构建

采用酵母双杂交系统,利用SMART技术,在酵母菌株AH109中构建了小粒野生稻全长cDNA文库,文库容量约为1×106,插入片段平均大小约为640bp。该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选。     

小麦DREB转录因子TaAIDFa的互作蛋白筛选

为进一步探讨DREB类蛋白的作用机理,以DREB类转录因子TaAIDFa为探针,利用酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选TaAIDFa的互作蛋白,进而探讨DREB转录因子介导的互作网络,以初步阐明DREB转录因子的抗逆机制。结果表明,通过酵母双杂交从cDNA文库中筛选到84个克隆,对其进行测序和Blast序列比对分析,得到4类与TaAIDFa互作的候选蛋白。同源性分析发现,这4类候选蛋白多与信号转导或免疫过程有关,说明TaAIDFa参与了植物逆境胁迫下的信号转导,可调控与逆境胁迫相关基因的表达。     

茄子 Enhanced disease susceptibility 1 互作蛋白的初步筛选与分析

前期研究表明,茄子 Enhanced disease susceptibility 1（SmEDS1）正调控茄子青枯病抗性,但是其抗病机理有待进一步研究。为筛选 SmEDS1 的互作蛋白,本研究构建 pGBK7-SmEDS1 诱饵载体,并利用酵母双杂交技术对相应的均一化 cDNA 酵母文库进行筛选。从 2 次独立的实验中筛选到 9 个克隆,其非冗余地编码 6 种蛋白,即 TCP 转录因子、DNAJ 分子伴侣、SnRK1 蛋白 α 亚基、氰酸酯酶、CIP4 蛋白和 1 个未知蛋白。基于这些蛋白的功能,推测 SmEDS1 可能通过与本研究筛选到 TCP 转录因子互作调控水杨酸的合成,进而调控茄子的青枯病抗性。     

甘蔗MYB转录因子基因ScMYB52-1的克隆及表达特性分析

MYB转录因子家族成员广泛参与植物的各种生物学过程,在调控植物适应非生物逆境过程中起关键作用。为分离甘蔗（Saccharum spp.）逆境响应MYB基因并研究其功能,本文应用3°RACE的方法,从甘蔗品种ROC22中克隆到一个R2R3-MYB转录因子基因,命名为ScMYB52-1。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列长度为1072 bp,开放阅读框（ORF）长度为696 bp,5°非翻译区长54 bp,3°非翻译区长322 bp。该ORF编码231个氨基酸,推导蛋白的分子量为26.65 kDa,含有2个串联的MYB结构域。ScMYB52-1推导蛋白与模式植物拟南芥中的MYB家族蛋白的进化树聚类分析结果表明,ScMYB52-1蛋白与AtMYB52和AtMYB54的亲缘关系较近;进一步的多序列比对分析结果表明,上述三者蛋白质N端的MYB结构域序列高度一致,且三者的预测蛋白质三级结构类似,表明它们可能具有类似的功能。实时荧光定量PCR结果显示,ScMYB52-1在甘蔗组培苗的根中对PEG处理总体上不敏感,在叶中仅在3 h时短暂上调;ScMYB52-1在叶中受外源ABA和NaCl胁迫的诱导,在处理0.5 h均迅速上调表达,表达量分别为对照的3.35倍和2.75倍,并在处理期维持高于对照的水平;在根中受外源ABA和NaCl胁迫的抑制,在处理0.5 h时就开始下调表达,在处理24 h时表达量分别下调为对照的12%和40%,并在处理周期内总体上维持低于对照的水平。亚细胞定位分析表明,ScMYB52-1-GFP重组蛋白定位在烟草叶肉细胞的细胞核中。酵母双杂交自激活活性鉴定结果表明,ScMYB52-1蛋白无自激活活性。以上结果表明ScMYB52-1参与了甘蔗对高盐胁迫的应答,并可能受ABA信号通路的调控,在叶和根中存在差异的调控机制。本研究结果为进一步理解该基因在甘蔗非生物逆境适应过程中的功能及分子调控机制提供了初步的信息。     

甘蓝型油菜热激蛋白Bnp23相互作用蛋白的筛选和鉴定

以甘蓝型油菜热激蛋白p23（Brassica napus hsp23, Bnp23）为诱饵蛋白,用酵母双杂交LexA系统筛选拟南芥幼苗的AD-cDNA（activator domain-cDNA）文库,分离了39个酵母双杂交阳性克隆,其中两个阳性克隆的cDNA片段均编码拟南芥黑芥子酶结合蛋白（Arabidopsis thaliana PYK10 结合蛋白1,AtPBP1）。Blastp搜索到油菜黑芥子酶结合蛋白BnMBP6与拟南芥PBP1同源。经体外实验进一步证实AtPBP1和Bnp23之间存在相互作用。酵母双杂交实验也证实Bnp23能够与BnMBP6相互作用。     

大豆GmWRKY52生物信息学分析及与GmNF-YA13互作研究

WRKY转录因子在植物生长发育及逆境调控过程发挥着重要作用。前期通过酵母双杂交筛选干旱处理后的大豆cDNA文库时发现GmWRKY52(NP＿001237726.2)可能与GmNF-YA13蛋白存在互作，为明确二者是否存在互作，本研究克隆GmWRKY52基因并进行生物信息学分析，利用酵母双杂交系统鉴定GmWRKY52和GmNF-YA13之间的互作关系。结果显示：GmWRKY52基因全长1 163 bp,编码1个由265个氨基酸组成的蛋白质，多序列比对和系统发育树分析结果说明GmWRKY52基因与野生大豆GsWRKY69(XP＿028186817.1)亲缘关系较近。酵母双杂交结果表明GmWRKY52和GmNF-YA13蛋白不存在相互作用。研究结果说明GmWRKY52与GmNF-YA13蛋白在酵母细胞内并不发生互作。     

大豆胚发育期酵母双杂文库的构建及与bHLH转录因子互作蛋白的筛选

构建了大豆幼胚生长期20~50 d DSN(duplex-specific nulease)均一化c DNA酵母双杂文库,总克隆数为2.8×107cfu。为了筛选能与已知大豆b HLH转录因子Gmb HLH3a相互结合的蛋白质,以转录因子Gmb HLH3a为诱饵蛋白构建诱饵载体,Gmb HLH3a诱饵载体无自激活活性,通过酵母双杂筛选到了两个能与诱饵蛋白相互作用的蛋白及其序列。     

百脉根结瘤因子受体NFR5及其相互作用蛋白的研究

以豆科植物百脉根的mRNA为模板，利用RT-PCR方法，扩增到1.0kb结瘤因子受体5（nod factor receptor NFR5）蛋白激酶结构域的DNA片段（nfr5-pk），并将该片段克隆到酵母双杂交BD载体pGBKT7上。通过酵母双杂交技术，筛选接种根瘤菌的百脉根AD-cDNA酵母双杂交文库，从文库中分离到与nfr5-pk相互作用的221个阳性克隆。从这些阳性克隆酵母中分离AD质粒经反复验证，对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析。通过NCBI数据库比对分析鉴定出小G蛋白Rop6等六个与NFR5-PK相互作用的不同蛋白，为进一步研究NFR5基因的功能和调控机制提供了材料。     

酵母双杂交系统筛选与水稻条纹病毒Pc2互作的寄主蛋白基因片段

水稻条纹病毒编码的Pc2蛋白在病毒侵染及宿主症状发生中起作用。研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染与致病的分子机制。分别将编码Pc2 N端（Pc2-N）与Pc2 C端（Pc2-C）的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上，并构建水稻叶片cDNA文库，然后分别用Pc2-N和Pc2-C为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明，诱饵载体中插入的Pc2-N和Pc2-C编码框和氨基酸序列均正确。Pc2-N对酵母菌株AH109无毒性和自主激活能力，但Pc2-C对酵母具有细胞毒性。文库滴度为4×107 CFU/mL，且大多数插入片段在500~2 000 bp之间。利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库，获得有8个候选阳性克隆。经序列测定和BLAST分析结果表明，这些克隆共编码5种蛋白，主要为胁迫相关蛋白与光系统相关蛋白。     

Analysis of nutritional components of eight famine foods of the Republic of Niger

In the western Sahel, indigenous plants become important staples when cereal harvests are inadequate to support populations inhabiting that region of Africa. The purpose of this study was to assess the nutrient content of several of these edible wild plants. The leaves of the following seven plant foods were analyzed: Ziziphus mauritiana, Cerathotheca sesamoides, Moringa oleifera, Leptadenia hastata, Hibiscus sabdarifa, Amaranthus viridi, and Adansonia digitata. The fatty acid, vitamin E, carotenoid, selected mineral and amino acid contents of these plant foods were determined. These same analyses were performed on the fruit of the Adansonia digitata. In quantitative and qualitative terms, Amaranthus viridis was found to be an excellent source of protein. Its amino acid composition compared favorably to that of a World Health Organization (WHO) protein standard. It also contained considerable amounts of the two fatty acids that are essential in humans (linoleic and -linolenic) and a number of minerals including iron, magnesium, calcium and zinc. The leaves of Hibiscus sabdarifa contained an appreciable quantity of protein the composition of which was comparable to the WHO standard. The mineral content of the leaves of this plant was also exceptionally high; noteworthy was its high zinc content. H. sabdarifa also contained significant quantities of the two essential fatty acids. Ziziphus mauritiana was an excellent source of the essential fatty acid linoleic acid and several of the metals including iron, calcium, magnesium and zinc. Its content of other essential nutrients, however, was rather low. In general, Adansonia digitata leaves were nutritionally superior to the fruit of the tree; however, the fruit did contain useful quantities of potassium, phosphorus, zinc and -linolenic acid. The Leptadenia hastata leaves were an especially good source of lutein and -carotene. These data should be useful to the people who inhabit the western Sahel in helping them devise healthy diets during times when cereal staples are in short supply.     

狗牙根诱变后代抗寒性评价

通过电解质外渗法和匍匐茎恢复试验对‘阳江’狗牙根及其12个通过形态鉴定选出的坪用价值高且花序密度低的诱变后代进行抗寒性鉴定。电解质外渗法结果表明:诱变后代间的抗寒性具有较大差异,其叶片半致死温度(LT₅₀)的变异范围为-7.6～-0.2℃(最低值与最大值相差7.4℃);参试材料抗寒性由强到弱依次为M18>M4>M26>M28> M22>阳江>M29>M31>M10>M37>M16>M1>M25,其中,有5个诱变后代抗寒性优于亲本,分别是M18、M4、M26、M28、M22。匍匐茎恢复实验结果表明:诱变后代M1、M22、M26、M31、M25在0℃和-5℃低温胁迫后的恢复生长率都高于亲本,恢复能力均优于亲本;M10、M37、M28在-5℃低温胁迫下,恢复生长能力低于亲本,抗寒性相对较弱,M16和M4在0℃和-5℃低温胁迫下,恢复生长率都低于亲本,抗寒性明显弱于亲本。综合2种方法鉴定结果显示:诱变后代M1、M25的恢复能力较强;M4、M28的叶片抗寒性较好,青绿期较长;M22、M18、M26的叶片抗寒性和匍匐茎恢复能力均较强;M29,M31的叶片抗寒性和匍匐茎恢复能力与亲本相似;M10、M16、M37的叶片抗寒性和匍匐茎恢复能力均较弱,整体抗寒性较弱。     

芦笋枯萎病病原鉴定

对造成福建省漳州市东山县的芦笋枯萎病病原菌进行分子鉴定,以期确定病原菌的属、种名,为防治该病害寻求理论依据。试验对分离纯化的病原菌核糖体DNA的ITS区进行测序,在Genbank中搜索其同源性并构建它们的系统发育树,结果表明：引起芦笋枯萎病的病原菌是镰刀属中的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),且病原菌之间的同源性高达89%,遗传差异不显著。     

Size and frequency of occurrence of pre-roost gatherings of starlings

One hundred and fifty-six pre-roost gatherings of starlings were observed at 28 sites around a roost in west Norfolk during winter. Pre-roost gatherings occurred more frequently at individual farmyards compared with individual fields, but 82% of the sites where gatherings occurred were on fields. The size of gatherings was greater, the closer to the roost. Birds in pre-roost gatherings on fields of autumn-sown winter wheat spent most of the time feeding and had a diet composed almost exclusively of wheat seeds. Birds in gatherings on grass fields also fed intensively whereas only 31% of birds at farmyards were feeding. The implications that these results have with regard to potential damage to fields of winter wheat and around farmyards are discussed.     

橡胶树丛枝病病原的抗血清制备与应用

以感染橡胶树丛枝病病原的长春花为材料,制备得到橡胶丛枝病病原菌抽提液,以抽提液为抗原免疫家兔,制备抗血清,经微量沉淀测定,抗血清效价为１：２０４８。应用橡胶丛枝病抗血清检测橡胶褐皮病,无症苗木检出率达３０％－３７％,可疑的褐皮病树检出率达８５．７％。     

农杆菌注射法瞬时转化荔枝果实组织的研究

为了寻找一种高效的荔枝果实瞬时基因表达方法,本研究以荔枝品种‘新球蜜荔’（Litchi chinensis Sonn. var. ‘Xinqiumili’）为试材,利用农杆菌注射法对荔枝果实组织进行转化,研究了果实发育时期、菌株种类、注射部位、取样时间、菌液浓度等对转化效率的影响。结果表明：选择果肉已完全包裹种子的Ⅱb期果实进行连体注射,在果柄、果皮、种子、果肉分别注入OD₆₀₀值为2.4的农杆菌菌株GV3101,4 d后取样进行检测,4个组织的GUS染色率较高。本研究成功建立了适用于荔枝果实的基因瞬时表达系统,为今后快速鉴定荔枝果实相关基因功能提供了基础。     

《生物安全法》实施背景下基因编辑技术的安全评价与监管

2020年10月17日,《中华人民共和国生物安全法》(以下简称《生物安全法》)通过全国人大常委会的审议,自2021年4月15日起施行.生物技术的研究与应用安全是《生物安全法》涉及的主要内容之一,基因编辑作为近几年生物技术领域的研究热点,其安全性评价和监管备受关注.本文概述了基因编辑技术的应用现状,比较了不同国家对基因编...     

蝉拟青霉疏水蛋白PChyd基因表达模式分析及敲除载体构建

为深入研究昆虫病原真菌蝉拟青霉疏水蛋白PChyd基因的功能,根据蝉拟青霉基因组信息克隆疏水蛋白PChyd基因,对该基因序列进行生物信息学分析,使用qRT-PCR技术对其在不同培养条件或阶段下的表达模式进行分析,并通过酶切酶连的方法构建了该基因的敲除载体。结果表明：PChyd基因的开放阅读框序列全长303 bp,编码100 aa,包含22 aa的信号肽序列和70 aa疏水蛋白功能区域。系统发育分析显示该基因与粗糙虫草菌亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示PChyd基因在PDA培养的菌丝体、诱导的附着胞、诱导的芽生孢子中表达量显著高于另外2个样品,其中芽生孢子表达量最高,暗示该基因在蝉拟青霉侵染初期和在昆虫血腔中定殖阶段可能具有重要作用。凝胶电泳结果表明,成功构建了该基因的敲除载体,扩增出含有上臂、HPH、下臂的3356 bp左右的片段。本研究为进一步探究蝉拟青霉疏水蛋白PChyd基因的致病机理、生防工程菌的改造奠定了基础。     

波罗蜜叶片突变体叶绿素含量测定和超微结构观察

波罗蜜（Artocarpus heterophyllus）是一种热带果树,至今对其突变体的研究少有报道。本研究以波罗蜜叶片为试验材料,探究其叶片出现白化和返绿现象的可能原因。（1）用分光光度计法、比色法测定波罗蜜叶片突变体和正常绿叶的叶绿素及叶绿素前体物质含量;（2）用叶绿素酶Elisa试剂盒测定叶绿素酶活性;（3）用透射电子显微镜对叶绿体的超微形态结构进行观察。研究结果表明：（1）不同叶色所产生的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量、类胡萝卜素含量均存在显著差异;（2）波罗蜜叶片突变体和正常绿叶的叶绿素合成前体物质含量之间并没有出现显著性差异;（3）对波罗蜜叶片的叶绿素酶活性进行测定时,发现其活性出现显著差异,但对其叶绿素含量的差异性并没有产生较大影响;（4）观察波罗蜜叶片内叶绿体超微形态结构时,发现正常绿叶的叶绿体形态完好且数量较多,白化叶和返绿叶的叶绿体内部结构存在缺陷,其原因是叶绿体基粒构建阶段受阻;基于测定波罗蜜叶片中的叶绿素、叶绿素前体物质含量和叶绿素酶活性,并观察波罗蜜叶片内叶绿体的超微形态结构,对得到的数据结果进行比较分析。本研究推测是在叶绿素合成阶段,原脱植基叶绿素合成叶绿素时受阻及叶绿体发不良导致波罗蜜出现白化和返绿现象,为今后进一步综合研究波罗蜜突变体提供理论依据。     

Mechanism of action of insecticidal secondary metabolites of plant origin

Insect pest management is facing the economic and ecological challenge worldwide due to the human and environmental hazards caused by majority of the synthetic pesticide chemicals. Identification of novel effective insecticidal compounds is essential to combat increasing resistance rates. Botanicals containing active insecticidal phytochemicals appear to be promising to address some of these problems. Therefore, there is a continuous need to explore new active molecules with different mechanisms of action. Secondary metabolites present in plants apparently function as defense (toxic), which inhibits reproduction and other processes. The phytochemical biomolecules could be used for maximizing the effectiveness and specificity in future insecticide design with specific or multiple target sites, while ensuring the economic and ecological sustainability. In this article, the current state of knowledge on phytochemical sources and insecticidal activity, their mechanism of action in insects, resistance, and promising advances made in phytochemical research are reviewed.