胆盐水解酶基因的克隆及其在干酪乳杆菌CECT5276中的分泌表达

本试验旨在克隆植物乳杆菌(L.plantarum)DPP8的胆盐水解酶(BSH)基因,并在干酪乳杆菌(L.casei)CECT5276中对其进行表达.通过PCR技术克隆L.plantarum DPP8的BSH基因,然后将该基因重组到L.casei表达载体pMJ67-sp中,获得了重组表达质粒pMJ67-sp-BSH,再...     

植物乳杆菌ST-Ⅲ蛋白酶活性的研究

植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lb.pzantarum ST-Ⅲ)是一株具有降低血清胆固醇能力的益生菌,其在脱脂乳中生长缓慢,产酸能力弱.实验选取一株凝乳性较好的植物乳杆菌CZ 2112作为参照,对植物乳杆菌ST-Ⅲ蛋白酶活性进行研究.植物乳杆菌ST-Ⅲ蛋白酶活性及蛋白水解能力比植物乳杆菌CZ 2112低,而氨肽酶和羧肽酶活性与之差异较少,推测得出植物乳杆菌ST-Ⅲ在脱脂乳中不能很好生长和凝乳的原因是该菌株蛋白酶活性较低,生长初期不能很好利用外源蛋白质营养.在添加鱼蛋白胨等促进生长后,植物乳杆菌ST-Ⅲ可以将蛋白质、多肽水解成一系列的寡肽或氨基酸,满足菌体生长的氮素营养.     

西藏灵菇中Lactobacillus casei LC577的分离鉴定及特性

从西藏灵菇中分离到一株菌株,命名为LC577,经形态学特征、16S rRNA基因序列及生理生化特性分析,鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。结果表明:干酪乳杆菌LC577具有良好的产酸能力,进行脱脂乳发酵后具有浓郁的干酪香气;同时该菌株具有一定的耐酸耐胆盐能力,在模拟人工胃液环境中培养4 h后,活菌数出现微弱增加,而经3 g/L牛胆汁作用4 h后,活菌数降至6.15×10~5 CFU/mL。     

不同植物乳杆菌对樱桃谷肉鸭生长性能、血浆生化指标、屠宰性能与肌肉品质的影响

试验旨在研究产胆盐水解酶植物乳杆菌对樱桃谷肉鸭生长性能、血浆生化指标、屠宰性能与肌肉品质的影响.选取540只1日龄樱桃谷肉鸭,随机分为3组,1个对照组和2个试验组,每组6个重复,每个重复30只.各组均饲喂基础日粮,2个试验组在饮水中分别添加无胆盐水解酶植物乳杆菌和产胆盐水解酶植物乳杆菌,活菌数含量均为106 cfu/m...     

植物乳杆菌L01体外解离胆盐能力及机制的初步研究

试验研究植物乳杆菌L01对人体6种结合胆盐解离能力,并对胆盐水解酶(BSH)的解离特性进行考察。通过对植物乳杆菌L01脱除脱氧胆酸能力测定,从侧面考察植物乳杆菌L01的降胆固醇能力并对其脱除机制进行探讨。试验结果表明:植物乳杆菌L01可从培养基中去除40.16%的混合胆盐,加入溶菌酶处理后,胆盐解离率有显著提高(P0.05),考察发现植物乳杆菌L01产生的胆盐水解酶对甘氨鹅脱氧胆酸钠的水解活性最高。此外,植物乳杆菌L01对脱氧胆酸(DCA)脱除能力达到45.50%。由此得知,植物乳杆菌L01具有较强的降解胆固醇能力。     

干酪乳杆菌的筛选及其在褐色活性乳饮料中的应用

以产酸速度、pH2.5人工胃液耐受性、pH8.0人工肠液耐受性、0.3％胆盐耐受性,对传统发酵乳制品中分离的298株干酪乳杆菌进行筛选,并对其在褐色活性乳饮料中的应用进行评价.结果表明:共有1 1株干酪乳杆菌在脱脂乳中产酸速度显著快于其他菌株(P＜0.05),其中IMAU60143、IMAU70020和IMAU10510具有优良的人工胃肠液和胆盐耐受能力(P＜0.05),此3株干酪乳杆菌在褐色活性乳饮料中具有良好的贮藏稳定性,其中IMAU70020于4℃贮藏28d活菌数仍大于5.0×108CFU/g.     

两株干酪乳杆菌生物学特性的研究

在模拟人体消化道环境中,对2株干酪乳杆菌耐酸、耐胆盐和耐NaCl等生物学特性进行了研究.结果表明,2株干酪乳杆菌在pH值为2.5～4.5的人工胃液或人工肠液中作用3h后均能生长,活菌数达到1010个/mL左右.此外,在胆盐浓度为2.5g/L或高盐浓度比例为7.5%的条件下亦能正常生长.该研究表明,这2株菌株在人体或动物中具有较好的适应性,可以作为益生菌用于食品工业.     

益生菌与功能发酵乳开发研究进展

近10 年来，随着先进研究方法的使用和研究内容的不断深入，对益生菌的认识取得重大进展，尤其是对益生菌促进健康作用的机理逐渐清晰，益生菌制备技术和产业化技术更加成熟，为新型发酵乳的开发提供了坚实的发展基础。本文对益生菌功能机理、遗传转化及代谢调控的研究现状和发展进行阐述，介绍分离自内蒙古马乳酒中的干酪乳杆菌LC2W和分离自发酵蔬菜中的植物乳杆菌ST-Ⅲ的益生特性、基因组及产胞外多糖特性，并进一步探讨基于植物乳杆菌增殖技术开发含高活菌数的纯植物乳杆菌发酵乳品，以期为益生菌和功能发酵乳的应用开发提供理论依据。发酵乳品是益生菌的良好载体，吸收现代益生菌科技成果，加强循证医学方法论证，基于生物活性效应分子及生物活性评价，增加临床研究数据，新型发酵乳将为人类健康做出更多贡献。     

不同乳酸菌添加剂对谷子青贮品质及CNCPS组分的影响

试验探究了4种不同类型乳酸菌添加剂对谷子青贮品质和CNCPS组分的影响,设置了5个处理,分别为对照组、副干酪乳杆菌LP1 (Lactobacillus paracasei)组、植物乳杆菌LP2 (Lactobacillus plantarum)组、干酪乳杆菌LC (Lactobacillus casei)组和布氏乳杆菌LB (Lactobacillus buchneri)组,测定谷子青贮的发酵品质、营养成分和CNCPS组分。结果表明,与对照组相比,副干酪乳杆菌LP1组pH值和丁酸（BA）含量显著降低,乳酸（LA）含量显著上升（P<0.05）,副干酪乳杆菌LP1组的中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量低于其他处理（P<0.05）。与对照组和植物乳杆菌LP2组相比,其他添加剂处理组可溶性碳水化合物（WSC）含量显著降低（P<0.05）,淀粉（Starch）含量显著升高（P<0.05）;布氏乳杆菌LB组中速降解蛋白（PB2）含量显著高于其他处理组（P<0.05）,慢速降解蛋白（PB3）和非结构碳水化合物（NSC）含量显著低于其他处理组（P<0...     

酸奶冰淇淋的发酵剂复配与益生菌存活率的测定

为了开发富含益生菌的酸奶冰淇淋产品,本研究以产酸、产黏以及感官得分为综合评价指标,对发酵剂嗜热链球菌MN-1、嗜热链球菌MN-2分别与保加利亚乳杆菌MN-3、保加利亚乳杆菌MN-4的组合效应进行了研究。结果表明,当嗜热链球菌MN-2与保加利亚乳杆菌MN-4组合,且球菌与杆菌添加比例为10∶1时,最先到达发酵终点,且产品感官评分最高。将婴儿双歧杆菌BI07、乳双歧杆菌BB12、嗜酸乳杆菌La14与干酪乳杆菌LC11加入到酸奶冰淇淋中,在贮藏第90天时干酪乳杆菌LC11活菌数大于106cfu/g,可以作为益生菌酸奶冰淇淋的益生菌株使用。     

4种芽孢杆菌来源木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶活分析

研究旨在比较4种不同来源木聚糖酶基因在大肠杆菌E.coli BL21中表达后的酶活等性质,为生产中筛选高表达量及耐极性木聚糖酶基因提供依据。根据已发表的木聚糖酶基因序列设计引物,分别扩增出浸麻芽孢杆菌(B.macerans)B3、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)B6、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)B10和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B12的木聚糖酶基因片段,经克隆表达后获得4种工程菌。经培养和IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳检测及酶特性分析。测序结果表明,4个基因的开放阅读框均为642 bp。其中前3种木聚糖酶基因均为首次报道。4种重组木聚糖酶在55℃下的酶活分别为:36.16、3.85、7.22、98.98 U/ml。4种重组木聚糖酶的最适反应温度均在50~60℃,且枯草芽孢杆菌木聚糖酶最为耐热。结果提示,枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶具有较高的酶活和较好的耐热性。     

禽流感病毒血凝素基因在大肠杆菌中的表达

采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒HAI基因,将HAI结构基因克隆于pGEX-T载体上,测序结果表明插入的片段为HAI目的基因.切下目的基因HAI,重组到含有谷胱甘肽(GST)的融合蛋白原核表达载体PGEX-4T-2,获得的重组质粒经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明HAI基因插入的位置、大小和读码框架均正确.证明成功构建了融合表达载体pGEX-HAI.构建好的重组质粒,经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌BL21中得到了大量表达,经过4 h表达量既达到高峰.融合蛋白GST-HAI的分子量为62KD,以包涵体形式存在.Western-Blot分析表明,融合蛋白能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性.     

多粘类芽孢杆菌纤维素酶基因bglA,bglB和EG在乳酸菌中的分泌表达

通过PCR扩增获得乳酸菌(Lactobacterium lactis MG1363)的usp45基因,将其克隆到乳酸菌(L.lactis)食品级表达载体pNZ8048中获得分泌型表达载体pNZ-X;然后将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及内切β-葡聚糖酶基因EG分别连接载体pNZ-X,获得重组质粒pNZ-X::bglA,pNZ-X::bglB和pNZ-X::EG,将3个质粒电转导入L.lactis NZ9000,得到重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ-X::bglA、L.lactis NZ9000/pNZ-X::bglB和L.lactis NZ9000/pNZ-X::EG,并测定分泌性表达的BglA,BglB和EG的酶活性。结果显示:3个酶大小均在50kU;DNS法测定酶活力表明重组菌株的酶活力显著低于多粘类芽孢杆菌的酶活力(P0.05),但具有一定的活性;刚果红染色结果也表明重组乳酸菌分泌产生的酶可产生明显的水解圈。试验为重组纤维素酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案,为秸秆的降解研究奠定了基础。     

表达Ag85基因重组卡介苗的构建

为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag85基因片段的重组pMV261质粒。分别对重组质粒进行PCR、双酶切鉴定后,通过电击转化转染到卡介苗感受态细胞中,利用Kan耐药基因筛选获得重组卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鉴定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表达,再对构建成功的重组卡介苗进行培养,用于后续试验。PCR扩增结果表明,构建的重组卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分别为1 447、1 402、1 453和1 330 bp,与预期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting结果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗细胞内成功表达。本试验利用基因工程技术成功获得4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,将其分别命名为rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C、rBCG/Ag85D。本研究可为进一步将其他抗原基因插入卡介苗细胞构建重组疫苗及疫苗研究提供材料。     

Survey of restriction-modification systems and transformation in Mannheimia haemolytica and Pasteurella trehalosi

A significant obstacle to molecular studies of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, has been its resistance to genetic transformation. The lack of competence of many M. haemolytica strains has been attributed to the presence of restriction modification systems. In this study, representative strains of 12 M. haemolytica serotypes and four Pasteurella trehalosi serotypes were successfully transformed by electroporation using a recombinant vector derived from the native M. haemolytica A1 serotype plasmid pNSF2176. Transformation was achieved despite PCR-based evidence for the presence of genes encoding a type I restriction enzyme, phaI, and a type II restriction enzyme hsdM, in each of the M. haemolytica strains.     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0的构建与免疫原性分析

利用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶分别对pMG36e与pMD19-T-E0进行双酶切,将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e,构建牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0。提取重组质粒pMG36e-E0,进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒pMG36e-E0转化到大肠杆菌DH5α中进行表达,对表达产物进行SDSPAGE和Western-blotting鉴定。用表达的E0蛋白二次免疫家兔,间接ELISA法检测其血清抗体水平。结果,重组质粒经双酶切得到大小分别约为3 600、691bp的2个片段,PCR扩增出691bp的片段,双酶切与PCR鉴定结果表明目的基因E0正确插入到载体pMG36e中。SDS-PAGE电泳结果表明E0基因在大肠杆菌获得了表达,表达产物相对分子质量大小约为27 000。Western-blotting分析结果证明表达产物能被BVDV阳性血清所识别。ELISA检测结果证明表达的E0融合蛋白能刺激动物产生抗体,具有天然蛋白的免疫原性。     

PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌CP-16脂类水解酶的研究

本试验旨在通过异源表达获得地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CP-16的脂类水解酶,并探究其在羽毛降解过程中的作用。试验以地衣芽孢杆菌CP-16基因组DNA为模板,扩增脂类水解酶基因,转化入大肠杆菌中表达,获得重组酶L-4。研究重组酶L-4的适宜p H、p H稳定性、适宜温度、温度稳定性以及有机溶剂和金属离子对其相对活性的影响,同时探究其对角蛋白酶K水解天然羽毛角蛋白的作用。结果显示,获得的脂类水解酶基因大小为747 bp,编码248个氨基酸,在大肠杆菌中成功表达出重组酶L-4,其分子质量约为28.3 ku,酯酶活性为0.42 U/m L,适宜p H为6.5,适宜温度为50℃;在p H 6.5~9.5条件下处理30 min相对活性保持80%以上,在低于50℃温度条件下处理30 min相对活性保持70%以上。二价铁离子(Fe~(2+))、钠离子(Na~+)、锰离子(Mn~(2+))、钙离子(Ca~(2+))对重组酶L-4相对活性具有激发作用,钡离子(Ba~(2+))、锌离子(Zn~(2+))、铜离子(Cu~(2+))、镍离子(Ni~(2+))对重组酶L-4相对活性具有抑制作用。当有机溶剂浓度为30%时,重组酶L-4在二甲基亚砜(DMSO)和甲醇中保存97%和85%的相对活性,在丙酮、乙醇中保存45%以上的相对活性,在异丙醇中保存不到20%的相对活性,而在乙腈中相对活性基本完全丧失。用重组酶L-4预处理天然羽毛底物,可提高角蛋白酶K对底物的水解效率,促进率为4.32%。由此可见,脂类水解酶可降解羽毛表层脂质,可在促进角蛋白酶水解羽毛角蛋白中发挥作用。     

表达猪链球菌溶血素基因的减毒沙门氏菌的构建及鉴定

将猪链球菌溶血素（suilysin，SLY）基因克隆入原核表达栽体pBV220，将重组质粒再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SV4089株，经PCR和酶切鉴定，构建成携带猪链球菌溶血素基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。结果表明：该减毒株具有相对安全性；用酶切和PCR鉴定法证实在无抗生素存在的条件下携带重组质粒的减毒株比较稳定；SDS-PAGE显示SLY能在宿主菌中进行表达。该结果为进一步研究制备猪链球菌口服活疫苗奠定了基础。     

扬奇青霉α-半乳糖苷酶agl1基因在大肠杆菌中的表达与纯化研究

提取扬奇青霉总RNA,反转录合成cDNA,PCR扩增α-半乳糖苷酶agl1基因的编码区DNA序列,连接到原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点,获得重组表达载体,转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导获得agl1基因的特异性表达。结果表明:8mol/L尿素变性处理后的重组蛋白,经过Ni2+亲和柱纯化,SDS-PAGE检测该重组蛋白分子量约82ku,与预测结果相符。纯化的酶蛋白依次经过6、4、2mol/L和0mol/L尿素梯度透析复性后,α-半乳糖苷酶酶活为0.4U/mL。