假单胞菌生物膜形成调控机制研究进展

假单胞菌是原料乳中常见的污染微生物,其会在乳品生产设备表面形成生物膜,导致设备腐蚀,且假单胞菌难以清除。同时假单胞菌形成的生物膜能促进假单胞菌耐热酶的分泌,还可以作为致病菌的生长基质,从而给乳品安全带来风险。本文总结了假单胞菌生物膜调控机制的研究进展和影响生物膜形成的环境因素,为假单胞菌生物膜的防控提供依据。     

原料乳中耐冷菌群及其产酶特点

耐冷菌及其分泌的耐热酶是原料乳中常见污染物,会导致乳制品腐败。通过16S rRNA基因测序分析了分离自上海地区原料乳的耐冷菌群,以及通过平板法研究不同耐冷菌的蛋白酶和脂肪酶活力。结果表明:所有的分离株属于9个菌纲,含33个菌属,其中数量占主要的菌属是假单胞菌(Pseudomonas)(55％)、不动杆菌(Acinetobacter)(10％)和黄杆菌(Flavobacterium)(5％),其余30个菌属占所有菌株数的30％。耐冷菌产酶能力平板法实验显示,大部分的耐冷菌都有产蛋白酶或脂肪酶的能力,不同菌属之间产酶特点存在差异。假单胞菌和黄杆菌主要表现为产蛋白酶活性,克雷伯氏菌(Klebsiella)主要表现为产脂肪酶活性,而大多数的不动杆菌没有产蛋白酶或脂肪酶活性。     

原料乳中耐冷假单胞菌的种类及其肽酶活力

在冷藏的原料乳中,假单胞菌经常出现并成为主导菌群,其分泌的耐热酶会使原料乳变质。对从原料乳中分离的102株假单胞菌经rpoB基因测序进行菌种分析,用偶氮酪蛋白测试所有假单胞菌在2种培养条件(30℃培养2d或6℃培养8d)下胞外肽酶的蛋白水解活性和耐热性。结果表明:荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是假单胞菌中最主要的菌种,其次是莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)和假单胞菌sp1 (Pseudomonas sp1)。不同假单胞菌菌种之间的产肽酶能力存在明显差异。大多数荧光假单胞菌(23/41)在不同温度(30℃和6℃)条件下培养后能产肽酶,而大多数的假单胞菌sp1不产肽酶,所有分离的莓实假单胞菌(13/13)只在6℃条件下产肽酶,大多数的假单胞菌所产肽酶都有热稳定性。在6℃培养条件下,荧光假单胞菌菌株M02有最高肽酶活力(11.78ΔA/ (h·mL)),其胞外肽酶最佳催化pH值为6.5,最佳催化温度为40℃。当M02的接种浓度为103 CFU/mL时,6℃培养5d就能使脱脂乳溶液产生沉淀。对耐冷假单胞菌的种类和产肽酶能力进行分析和考察有助于提高原料乳或乳制品的质量和安全性。     

致水貂出血性肺炎铜绿假单胞菌胞外产物生物活性及免疫保护力分析

胞外产物在细菌致病过程中发挥重要作用,为探索胞外产物在铜绿假单胞菌致病过程中的作用,首先从铜绿假单胞菌培养液提取其出其胞外产物,利用小鼠模型分析其致病性,并通过细胞证实了该产物对巨噬细胞功能的抑制作用,进一步测定其胞外产物的酶活性并利用LC-MSMS方法对铜绿假单胞菌胞外产物蛋白成分和功能进行分析。结果表明,铜绿假单胞菌胞外产物对小鼠有致病性,能够显著抑制巨噬细胞吞噬细菌活性,其具有淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、卵磷脂酶活性和溶血活性可能在这一过程中发挥关键作用。LC-MSMS分析鉴定所提纯的胞外产物中有153种蛋白成分,涉及多种酶类、细胞结构蛋白和功能性蛋白。用低剂量胞外产物免疫动物对于铜绿假单胞菌感染具有较明显的保护率,可达90%。本试验为揭示铜绿假单胞菌致病机理,研制新型疫苗奠定基础。     

原料乳中嗜冷菌种类及嗜冷芽孢杆菌研究进展

嗜冷菌能在原料乳冷藏条件下生长,其分泌蛋白酶和脂肪酶降解牛乳中的蛋白和脂肪,导致牛乳变质。本文归纳了原料乳中嗜冷菌的种类,总结嗜冷芽孢杆菌的危害研究进展,重点包括嗜冷菌常见种型、危害特点、分泌的蛋白酶和脂肪酶。最后探讨了嗜冷芽孢杆菌的研究方向。     

变质原料乳中假单胞菌的分离鉴定及产蛋白酶特性研究

[目的]为了解导致原料乳变质的微生物种类及其产蛋白酶活力。[方法]对广东省恒远市某规模化牧场提供的蛋白水解、脂肪上浮的变质原料乳稀释,涂布在MPC琼脂平板上。将平板于6.5 ℃恒温培养箱培养10 d,挑取形态不同的单菌落在LB液体培养基复壮增菌,提取其DNA,利用16S rDNA方法对分离的菌株进行鉴定,并对该菌株的蛋白酶活力及高温钝化后酶残留率进行测定。[结果]MPC琼脂板菌落形态单一,原料乳中分离鉴定出的两株菌均为霍氏假单胞菌,该菌株在28 ℃下对乳平板的水解圈为（15.35±0.56）mm,经135 ℃处理5 s,其蛋白酶残留率为43.63%。[结论]变质原料乳中分离到两株霍氏假单胞菌,并且该菌可产生热不敏感的蛋白酶,该酶的存在会造成原料乳中蛋白质水解,导致UHT乳在货架期内出现蛋白水解、胀包等质量问题。     

市售鸡蛋壳表面携带β-内酰胺酶耐药基因假单胞菌的分离鉴定

为研究鸡蛋壳表面携带耐药细菌的情况,试验选取吉林省四家蛋鸡养殖场内新鲜鸡蛋,采取传统细菌学方法从鸡蛋壳表面进行病原菌分离鉴定和药敏试验,PCR方法进行耐药基因检测。结果表明：成功分离鉴定出4株嗜麦芽窄食假单胞菌;抑菌试验结果显示,分离菌对环丙沙星敏感,对林可霉素、氟苯尼考、阿米卡星中敏感,对头孢曲松、阿莫西林、多粘菌素E不敏感;在4株假单胞菌分离株中检出CTX-M型β-内酰胺酶耐药基因。为进一步研究假单胞菌对蛋鸡养殖的危害和食品卫生安全提供了试验依据。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

铜绿假单胞菌oprD基因的克隆、表达与纯化

试验研究铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因oprD在大肠杆菌中的克隆及异源表达与纯化。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌oprD基因序列,设计合成了一对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了该目的基因,随后将其克隆于原核表达载体pET32a中,转化入大肠杆菌BL21 (DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并优化了表达条件,同时对表达的蛋白进行纯化。结果显示,试验成功构建了重组载体pET32a-oprD,oprD与组氨酸(His)标签形成的融合蛋白约为65 kD。最佳表达条件为菌液培养5 h时加入0.7 mmol/L的IPTG,37℃下诱导4.5 h,纯化的蛋白经SDS-PAGE分析获得了较高纯度的OPRD重组蛋白。研究结果可以为铜绿假单胞菌OPRD蛋白功能研究及其相关诊断试剂和疫苗的研制提供参考。     

嗜水气单胞菌不同分离株生化特性及胞外蛋白酶的检测

嗜水气单胞菌可引起多种宿主患病,该菌致病性与其产生的多种毒力因子特别是胞外蛋白酶有关。本研究检测了26株嗜水气单胞菌不同分离株的生化指标,采用脱脂乳平板法检测了胞外蛋白酶的产生情况,并利用PCR技术检测了2种胞外蛋白酶基因ahp-A(编码丝氨酸胞外蛋白酶)和eprCAI(编码温敏胞外蛋白酶)。结果表明,大部分菌株生化指标表现为蔗糖(+)、阿拉伯糖(+)、葡萄糖(+)、甘露醇(+)、鸟氨酸脱羧酶(-)、肌醇(-)、七叶苷(+);脱脂乳平板法检测发现,91.7%(22/24)的致病菌株均能产生胞外蛋白酶,而2株无毒株则不能产生,对2个胞外蛋白酶基因的检测也得到相似的结果。本研究将为嗜水气单胞菌的流行病学调查和致病机制的深入研究奠定基础。     

嗜冷菌对UHT乳品质的影响研究

摘要：原料乳嗜冷菌污染是影响uHT乳保质期的重要原因之一,并且嗜冷菌分布具有地域特征性本研究对蒙牛8个牧场原料乳中的嗜冷菌进行了分离和鉴定,确定了牧场常见嗜冷菌种类及特性,并分析了其对uHT乳品质的影响．结果表明,从试验样品中分离出的嗜冷菌为假单胞菌属、微球菌属和产碱杆菌属;牧场原料乳的嗜冷菌数量与气温有关,1～3月份数量较高,6～9月份数量较低;原料乳嗜冷菌数越多,UHTqL货架期越短;原料乳中嗜冷菌数达到10^5 CFU／mL时,对uHT乳苦味值的影响显著（p〈（1．（15）;嗜冷菌脂肪酶活力达10IU／mL、蛋白酶活力为15Iu／mL、25IU／mL时对UHTSfL苦味值的影响显著（P〈0．05）;原料gLpH值为6．7和3.5％2冷藏条件下,蛋白酶、脂肪酶活性较高,不利于uHT乳长期贮存、综上研究,原料乳中嗜冷菌数过多会严重影响uHT乳品质和风味;低温贮藏条件下,嗜冷菌产生的脂肪酶和蛋白酶会破坏UHT乳品质,因此不建议长期低温保存uHT乳、     

牛乳超高温灭菌前后芽孢杆菌分离鉴定

本文对牛乳UHT处理前后所含芽孢杆菌进行分离鉴定。经鉴定牛乳UHT处理前嗜热芽孢杆菌有4种、嗜温芽孢杆菌有5种,UHT处理后仅有4种嗜热芽孢杆菌。可见超高温灭菌可以杀死牛乳中的嗜温菌,实现商业无菌,但不能杀灭嗜热芽孢杆菌。     

应用浊度法快速鉴别原料乳、巴氏乳和UHT乳

试验采用浊度法来鉴别原料乳、巴氏乳及UHT乳。螯合盐对不同热处理的牛乳处理后显示出不同的浊度,根据这一特性筛选出可以较好区分原料乳、巴氏乳及UHT乳的螯合盐,该检测方法的原理为螯合盐主要通过螯合了牛乳中的钙、对酪蛋白胶粒进行了分散,并形成了一种新的螯合盐和钙的复合物,改变了酪蛋白的特性。结果显示柠檬酸盐（柠檬酸三钠、柠檬酸铵）和磷酸盐（六偏磷酸钠、多聚磷酸钠、焦磷酸钠）可以很好将牛乳中的酪蛋白胶粒进行分散,分散后的胶体溶液呈现出可以定量测量的浊度,但柠檬酸三钠对原料乳、巴氏乳和UHT乳分散后浊度的区分最为明显,D_{600 nm}值在0～0.15之间为原料乳,0.20～0.50之间为巴氏乳,0.60～1.00之间为UHT乳。浊度法可以快速的鉴别原料乳、巴氏乳和UHT乳,且操作简便,检测速度快,费用低。     

生乳与UHT灭菌乳中糠氨酸含量及其测定方法研究

本文研究了生乳与UHT灭菌乳中糠氨酸含量及其测定方法,并提出糠氨酸作为UHT灭菌乳中复原乳成分的标示物质,以鉴定UHT灭菌乳中是否掺入复原乳。结果表明,生乳中糠氨酸含量低于7mg/hg(按蛋白质计);乳粉中糠氨酸含量大于135mg/hg,不含复原乳的UHT灭菌乳中糠氨酸含量应小于140mg/hg(按蛋白质计)。使用高效液相色谱(HPLC)紫外检测糠氨酸含量,平均偏差<5%(n=5);回收率为98.2%。     

利用响应面法优化椰子风味发酵乳加工工艺

本文以脱脂乳和椰浆为原料进行风味发酵乳的制备.以感官评定为指标,在单因素试验的基础上,选取UHT椰浆添加量、发酵温度和发酵时间进行试验,利用响应面法对椰子风味发酵乳的最佳配方进行优化.结果 表明,对风味发酵乳的影响程度最大的因子是UHT椰浆添加量,其次为发酵时间.椰浆发酵乳的最佳配方为椰浆添加量16.5％,发酵温度45...     

APV灭菌机和ZY-DASB-6型无菌包装机的有效结合

以中亚灌装机和APV灭菌机的结合为例，重点探讨了基于巴氏消毒乳生产基础上的UHT灭菌乳的加工技术。主要包括嗜冷菌、芽孢、耐热芽孢的检验和UHT灭菌、无菌灌装技术。     

UHT乳在货架期内理化性质的变化研究

本文研究了UHT全脂乳在37℃温度下,酸度、黏度、蛋白水解度和酒精稳定性的变化情况,并得出UHT乳在37℃温度下的货架期。