Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测技术研究

通过苏云金芽孢杆菌(Bt)HD-73培养,提取Bt晶体蛋白Cry1Ac,经酶解后获得高抗虫活性蛋白。免疫新西兰白兔得到高纯度的Bt晶体蛋白1Ac抗体,用125I标记抗原,研究和建立了Bt晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测技术,该试剂盒用磁性微粒作分离剂,不需离心即可分离,简化了测定步骤,检测结果达到国外同类产品(酶联免疫试剂盒)的水平。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。     

Cry1Ac蛋白降解菌株FJSB3的分离鉴定及降解特性

从转Cry1Ac基因水稻种植田土壤中,分离纯化得到1株能高效降解Cry1Ac蛋白的细菌FJSB3。通过表型特征、16S rDNA扩增和电镜观察,初步鉴定FJSB3为寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。FJSB3发酵液能降解粗Bt蛋白。通过单因素试验确定FJSB3降解水稻秸秆中Cry1Ac蛋白的最适条...     

转GFM Cry1A基因玉米自交系及其杂交种的抗螟性鉴定

对获得的6个转GFM Cry1A基因玉米(zea mays)株系的T5代PCR分析证明,转基因株系是稳定遗传的.以此抗虫系为亲本与常规自交系配制了四密25Bt、通单24Bt和吉单209Bt3个杂交种.转基因自交系和杂交种的抗螟性鉴定结果表明:转基因系间抗虫性差异极显著,同一转基因系单株间也存在差异.抗螟性强的4个株系比受体对照平均蛀孔数减少70%、茎秆虫孔隧道长度减少80%、存活的虫体长度减少70%,差异显著,达到了高抗水平.对6个转基因抗虫系进ELISA检测,毒蛋白表达量平均占总蛋白0.16%,最高的达0.19%.杂交组合四密25Bt、通单24Bt和吉单209Bt群体内平均虫孔隧道长度与常规杂交种对照相比,分别减少39.97%、36.2%和53.83%,平均减少43.36%,抗虫性明显提高.农艺性状鉴定结果显示,转基因系配制的杂交种与对照在株高、穗长、穗行数、行粒数和百粒重上无显著差异.研究认为,Bt基因可用于玉米的抗螟性改良,为转基因抗虫玉米自交系能够直接用于玉米杂交种改良提供了依据.     

双Bt基因提高青花菜对菜粉蝶和小菜蛾抗性

以青花菜（Brassica oleracea L.ssp.italica）下胚轴为外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）晶体毒蛋白基因Cry1Ac和Cry1C分别导入青花菜栽培品种绿彗星中,各获得35株卡那霉素抗性植株。分别以Cry1Ac和Cry1C特异引物对转基因植株进行PCR扩增,结果得到27株Cry1Ac阳性植株和13株Cry1C阳性植株。以目的基因Cry1Ac和Cry1C为探针,进行Southernblot分析,证明多数植株目的基因已经整合到青花菜基因组中。对含有单拷贝目的基因植株自交纯合后通过有性杂交获得带有Cry1Ac和Cry1C双价的转基因青花菜。利用RT-PCR检测Bt基因在转基因植株中的表达情况,发现不同株系间在RNA水平上存在显著的表达差异,部分株系中双价Bt同时得到表达。ELISA检测转基因植株Bt毒蛋白含量为0.12～0.82μg/gFW。结合室内和田间饲虫试验,证明抗虫效果与Bt毒蛋白表达水平正相关。通过多世代选择,获得高抗菜粉蝶（Pieris rapae L.）和小菜蛾（Plutella xylostella L.）的纯合转基因青花菜材料。双价抗虫基因共同作用,提高了青花菜的抗虫性。     

转Cry1Ac和Cry1A+CpTI基因棉花粉对柞蚕生长发育影响的评价*

柞蚕(Antheraea pemyi)是中国华北和东北地区大面积人工野外饲养的重要经济昆虫,以天然柞林形成的蚕场与棉花常处于同一生态系统中。采用田间花粉沉积量测定结合室内生物测定的方法评价了转Cry1Ac基因和Cry1A CpTI基因棉(Gossypium hirsutum)花粉对柞蚕生长发育的生态风险。花粉沉积量测定表明,棉田内1m至棉田外1m的范围内,棉花花粉5d累积密度低于200粒／cm^2。用转基因抗虫棉花粉处理(花粉密度约l000粒／cm^2和10000粒／cm^2)的辽东栎(Quercus liaotungensis)叶片分别饲养蚁蚕至3龄末,结果显示,与非转基因棉花粉处理相比1～3龄期柞蚕的死亡率、发育历期、以及食物利用率、食物转化率、相对代谢速率、相对取食量和近似消化率等营养指标均无显著差别。表明两种供试转基因抗虫棉的种植不会对柞蚕的生长发育带来显著不利影响。     

转基因高粱Cry1Ab蛋白含量的比较研究

通过农杆菌介导法将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱恢复系115中,共获得13个独立的转基因株系,26株转基因植株,转化率为5.1%;GUS活性、PCR、Southern和Western杂交分析表明,此基因已整合进高粱基因组并得到正确表达。利用ELISA试剂盒测定Cry1Ab蛋白含量,结果表明,不同转基因植株的Cry1Ab蛋白含量有明显差异,最高可达0.850 μg/g,占可溶性蛋白的0.016%,还有一些转基因植株中不能表达;同一转基因植株的不同组织中表达量有明显差异,其顺序为：叶>颖壳>籽粒>根>茎;不同部位的叶片也有差异,其顺序为：中部叶>基部叶>新叶。     

转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田底栖动物群落的影响

转Bt基因抗虫水稻的成功研发,为有效控制鳞翅目害虫对水稻的危害提供了一条最为有效、经济的途径。稻田底栖动物群落是转Bt基因抗虫水稻的重要非靶标生物。为了解转Bt基因水稻对稻田底栖动物群落的安全性,以转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻‘华恢1号’(简写为HH1)为材料,以其非转基因亲本‘明恢63’(简写为MH63)为对照,以稻田底栖动物群落为指示生物,运用群落学方法,通过连续2年在江西南昌的大田试验,研究了转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻对稻田底栖动物群落的影响。结果显示:2012年在HH1与MH63的稻田中分别采集到底栖动物22种与25种,其中两生境中相同物种19种,两群落物种组成相似度为0.808 5,有7种优势种,优势种相似度为0.833 3。2013年在HH1与MH63稻田中分别采集到底栖动物26种与28种,两类稻田相同底栖动物22种,两群落物种组成相似度为0.814 8,有6种优势种,优势种相似度为1.000 0。2012年与2013年群落总体分析与时间动态分析均显示,两类稻田中底栖动物的物种丰富度、个体数量、多样性指数、均匀性指数及优势集中性指数变化趋势相似,且均无显著差异。结果表明:连续种植2年转Cry1Ab/Ac基因水稻HH1对南昌稻田底栖动物群落无明显的负作用。     

苏云金芽孢杆菌Ly30株cry1Ac基因的克隆及表达*

Bt菌Ly30株是中国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt),经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定。它含有cry1Ac基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pET-21b相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌(Eschrichia coli),获得含有cry1Ac基因重组质粒pEKLy1Ac。该基因的亚克隆和序列测定结果表明,其编码区为3534bp。编码蛋白分子量为133.5kD,含1177个氨基酸,等电点为4．8,与CrylAc3同源性最高,存在4个氨基酸的差异,与Cry1Ac10之间则有6个氨基酸的不同。该基因序列已在GenBank中登记注册为AF482767,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac14该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133．5kD蛋白带。室内生物测定结果表明,诱导表达的Cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性,其LC5o值分别为19.236和3276μg／g饲料。     

泥鳅生长及抗氧化 解毒酶系统对水体中转Cry1Ab/Ac基因水稻残遗物的响应

在泥鳅养殖水体中添加稻秆粉模拟水稻残遗物生境,研究了泥鳅生长和肝胰脏抗氧化酶(SOD、CAT)与解毒酶(GST)活性对转Cry1Ab/Ac基因水稻‘华恢1号’(HH1)的响应。设计以HH1稻秆粉10 mg·L?1、50 mg·L?1、100 mg·L?1和200 mg·L?1 4个梯度浓度处理泥鳅为试验组,以非转Bt基因水稻‘明恢63’(MH63)稻秆粉处理组为阴性对照,不加稻秆粉的基础饲养组为空白对照。结果显示:在4种稻秆粉浓度下,HH1组与MH63对照组泥鳅的特定生长率、肥满度、内脏系数及SOD、CAT和GST酶活性均无显著差异(P0.05);与空白对照比较,稻秆粉浓度升高对泥鳅生长的抑制逐渐增强,当浓度达到200 mg·L?1时,HH1组和MH63对照组泥鳅的特定生长率、内脏系数与CAT活性降低。研究结果表明,水体中低含量的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻HH1稻秆粉对泥鳅的生长与生理酶活性没有明显影响,高浓度HH1和MH63稻秆粉均使泥鳅的生长和生理酶活性显著降低,这可能与养殖水体中浓度较高的悬浮稻秆粉妨碍了泥鳅的呼吸和滤食,及稻秆粉的分解降低了水体p H和溶氧量有关。     

转CBF1基因增强水稻的耐逆性

为改良水稻(Oryza sativaL.)的耐逆性,以来源于成熟种子的胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐逆相关CBF1基因导入粳稻品种秀水11基因组,经GUS组织化学染色、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得一批转基因植株。T1代检测结果显示,所转基因已遗传给后代,且大多数株系的分离比符合3∶1。试验表明,在高盐与高渗胁迫下,转基因株系较非转化对照具有显著或极显著生长优势,表现苗高负增长率较小,长出的根数较多,根长较长;经低温胁迫处理后,转基因株系的叶片相对电导率显著或极显著低于对照。这些结果证明水稻转基因株系的耐逆性得到了增强。     

Assessing effects of transgenic Cry1Ac cotton on the earthworm Eisenia fetida

Transgenic insect-resistant cotton containing a synthetic version of the insecticidal toxin gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki has been planted in China in a large scale and may have adverse impacts on soil organisms. The leaves of the transgenic cotton and the non-transgenic parental cotton were collected and their impacts on the earthworm, Eisenia fetida, were tested in laboratory studies. No significant acute toxicity on E. fetida from oral exposure to the transgenic cotton line, GK19, was detected. The average weight, numbers of cocoons and new offsprings of E. fetida in the GK19 groups were all higher than in the Simian3 groups, but the differences were not significant.     

克螟稻秸秆cry1Ab基因表达产物对土壤生物学活性的影响

通过实验室条件下的秸秆还土试验 ,比较了转基因克螟稻及其亲本稻秸秆对土壤各微生物生理群的数量、土壤酶活性以及土壤呼吸强度的影响差异。与亲本对照相比 ,转基因克螟稻秸秆的添加对土壤好氧性细菌、放线菌和真菌的数量没有显著性影响 ;土壤氨化细菌、自生固氮菌和纤维素降解菌的数量在培养中期有些差异 ,但差异并不持续 ;对土壤蛋白酶、中性磷酸酶、脲酶和土壤呼吸强度没有显著性影响 ;土壤脱氢酶对转基因克螟稻秸秆的添加极其敏感。转基因克螟稻秸秆处理土壤中脱氢酶的活性在培养的前 9周明显地高于非转基因秸秆处理土壤 (p <0 0 5 )。尽管如此 ,培养 63d后 ,两种秸秆处理土壤脱氢酶活性差异逐渐消失。试验结果表明 ,转Bt基因克螟稻秸秆中的cry1Ab蛋白对土壤可培养的微生物没有明显的毒害作用     

口服急性毒性试验中Cry1C蛋白对鼠肠道菌群的影响

利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析不同ICR(institute of cancer researcch)小鼠在口服急性毒性试验中摄入Cry1C蛋白前后其肠道菌群的变化,进而对该抗虫蛋白的食用安全性进行较为深入的研究.DGGE图谱经UPGAMA聚类分析显示:小鼠间菌群结构存在较明显的个体差异;实验期间,对照组小鼠灌胃前后其菌群基本保持稳定;实验组小鼠试验前后肠道菌群变化差异较对照组明显.随着灌胃的停止其变化差异在经历过高峰后会随着停喂时间的延长而减小,且菌相有逐渐恢复灌胃前结构的趋势.从肠道菌相的角度分析可知:该抗虫Cry1C蛋白对小鼠是基本安全的.     

四价抗病虫除草剂RNAi植物表达载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗是重要的能源作物和糖料作物,面临病虫害日益严重问题。由于甘蔗遗传背景非常复杂,且缺乏必要种质,难以通过杂交培育抗病虫、除草剂聚合品种。基因工程技术提供了新方法。本研究利用BLAST比对获得甘蔗花叶病毒ScMV-CP基因和黄叶病毒ScYLV-CP基因的保守序列作为干扰序列,通过设计内切酶位点、生物合成和连接,获得全长687 bp的两个保守序列融合片段（MYCP）。并将其正向和反向插入中间载体pHANNIBAL上,形成双价病毒干扰结构。再通过在pHANNIBAL上添加SmaⅠ内切酶位点,将双价病毒干扰结构表达框和Cry1AC基因表达框结合;利用NotⅠ酶切,回收双价病毒干扰结构和Cry1AC基因表达框片段,连接到添加Bar基因表达框的表达载体pART27-Z上,构建了抗病虫及除草剂四价植物表达载体（pART27-MYCP-Cry1AC）。采用基因枪法将构建好的四价植物表达载体转入甘蔗品种FN15的胚性愈伤组织中,通过PPT（草丁膦）筛选获得了抗性再生甘蔗植株,经过PCR、定量以及Bt蛋白试纸检测,获得同时整合四种目的基因并表达的四价转基因甘蔗植株,为培育多抗甘蔗新品种提供了材料。     

华恢1号衍生系旱恢3T的选育及抗虫表现

水稻作为世界上主要的粮食作物之一,容易受到螟虫、稻飞虱、稻象甲等主要害虫为害造成减产.为改良节水抗旱稻的抗虫性,以华恢1号(TT51)为cry1Ab/Ac基因供体,与节水抗旱稻恢复系品种旱恢3号杂交,利用分子标记辅助选择技术对目标基因进行筛选,最终获得BC3F4纯合、稳定株系.通过对Cry1Ab/Ac蛋白的定性和定量检...     

Cry1Ab蛋白在不同土壤中的吸附与解吸

以转cry1Ab基因高粱为材料提取Cry1Ab蛋白，测定了Cry1Ab蛋白在6种土壤中的吸附与解吸，分析了Cry1Ab蛋白溶液浓度、土壤理化性质对Cry1Ab蛋白吸附与解吸的影响。结果表明，不同类型的土壤对Cry1Ab的吸附与解吸存在明显的差异，吸附量表现为红泥土〉灰化土〉青紫泥田〉黄筋泥〉黄松田〉红砂土，解吸量表现为灰化土〉青紫泥田〉红砂土〉黄筋泥〉红泥土〉黄松田；Cry1Ab蛋白溶液的浓度与吸附量和解吸量呈显著正相关，相关系数分别为0．86和0．99；土壤有机质、pH值与土壤吸附Cry1Ab蛋白的能力呈显著正相关，相关系数分别为0．83和0．82；土壤全氮、有效磷的含量与土壤吸附Cry1Ab蛋白呈正相关，土壤全氮、有效磷和速效钾的含量与解吸均呈负相关。土壤吸附、解吸Cry1Ab蛋白是加入Cry1Ab蛋白溶液的浓度及不同土壤的理化性质共同作用的结果。