利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探

基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。     

dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制效果

以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制必需的极早期基因ie-1和细胞释放型病毒CRV入侵关键基因gp64为靶序列,分别人工设计并体外转录出dsRNA I1(438 bp)和dsRNA G1(337 bp),用家蚕培养细胞BmN研究目标dsRNA对BmNPV复制、增殖的抑制效果。结果表明:dsRNA I1能有效地抑制BmNPV在BmN细胞中的增殖,最大抑制效果使培养液中的病毒滴度(TC ID50)比对照降低了104.30倍;dsRNA G1能显著地抑制新形成的病毒粒子的细胞侵染能力,最高可使培养液中的病毒滴度降低103.17倍。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。     

BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。     

家蚕AN品系的核型多角体病毒(BmNPV)抗性基因连锁与定位分析

不同家蚕品种对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的抵抗性存在较大差异。以对Bm NPV感染具有较强耐受性的家蚕品种华康2号杂交组合(F1)累代自交建立AN品系,以Bm NPV多角体悬液对该品系2龄起蚕经口添食的致死中浓度(LC_(50))为2.154×10~9m L~(-1),比对易感品系C108的LC_(50)提高了10~4倍以上。以易感品系C108作为回交亲本与AN品系组配F_1、BC_1、BC_2群体,2龄起蚕用浓度为1×10~8m L~(-1)的Bm NPV多角体悬液浸渍的桑叶饲喂12 h进行抗性遗传分析,表明AN品系对Bm NPV的高度抗性由位于常染色体的1个显性主基因控制。利用SSR分子标记和高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术对BC2F群体进行连锁分析,发现AN品系的Bm NPV抗性主基因位于第27连锁群。依据对BC2M定位群体的600余个个体的HRM分析结果,绘制了遗传总距离为29.1 c M的AN品系抗性主基因遗传连锁图,抗性主基因与S2800-9和S2801-352标记的遗传距离分别为5.2 c M、2.9 c M。通过对添食中等浓度(1×10~7m L~(-1))Bm NPV多角体悬液后存活个体的基因组DNA进行SSR分子标记HRM分析,推测家蚕抗性品系AN还存在多个分布于其他染色体的微效抗性基因。     

JAK/STAT途径对家蚕杆状病毒感染应答的初探

为了探讨家蚕抗病毒感染的免疫应答途径,通过非转座子介导将家蚕信号转导子及转录激活因子(STAT)基因表达盒(BmSTAT)导入家蚕卵巢培养细胞(BmN),经吉欧霉素(zeocin)筛选获得过表达BmSTAT的稳定转化BmN细胞。修饰型线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6感染结果显示:病毒感染后转化BmN细胞和正常BmN细胞的BmSTAT基因表达水平分别提高了32.70%和14.63%,表明家蚕JAK/STAT途径对杆状病毒感染有应答。比较转化BmN细胞和正常BmN细胞对杆状病毒感染的抵抗性,发现病毒对转化BmN细胞的感染比例低于正常BmN细胞,二者之间的感染率相差8.28～18.02个百分点;在感染病毒的转化BmN细胞中,β-半乳糖苷酶基因的表达水平比病毒感染正常BmN细胞的略低,推测这与转化BmN细胞中的BmSTAT水平(JAK/STAT途径信号)高于正常BmN细胞有关。然而,在BmN细胞中,BmSTAT基因的过表达尚不足以明显提高细胞对病毒感染的抵抗力。研究结果为进一步探讨家蚕JAK/STAT途径在病毒感染应答方面的作用奠定了基础。     

家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。     

利用家蚕细胞表达重组蝎毒素蛋白及其杀虫效果分析

用天然毒素蛋白杀灭害虫是农林病虫害防治的一个重要发展方向。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体蛋白基因的部分序列与蝎毒素蛋白基因(BmK ITa1)融合表达,SDS-PAGE分析通过融合表达策略构建的含有蝎毒素蛋白基因的重组病毒具有较高的蝎毒素蛋白表达水平,重组病毒vBmBac(polh-)PH5B/35B-BmK ITa1.6His,在家蚕BmN细胞内的BmKITa1蛋白表达水平分别为0.4、0.2 mg/mL。以家蚕和棉铃虫为供试昆虫,探讨融合蝎毒素蛋白的杀虫效果,结果表明:经口添食含融合蝎毒素蛋白的BmN细胞液对不同龄期家蚕幼虫均具有毒性,尤其对低龄幼虫的毒性较强,蚁蚕添食后的死亡率达80%;给1龄期的家蚕和棉铃虫幼虫经口添食含有不同剂量融合蝎毒素蛋白的BmN细胞破碎液,当添食剂量在2.8μg/头时,家蚕的死亡率即达100%,棉铃虫的死亡率达74%。研究结果提示:BmNPV多角体蛋白编码基因的部分序列与蝎毒素蛋白基因融合表达,可提高蝎毒素蛋白的表达水平,且重组病毒表达的蝎毒素蛋白具有较好的杀虫活性,在较低剂量下即可对低龄昆虫产生良好的杀灭效果。     

家蚕CIb1基因启动子活性分析

用PCR方法从家蚕基因组DNA扩增了家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂b1基因(CIb1)4个不同长度的启动子片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在脂质体介导下转染家蚕BmN细胞,体外分析了该基因启动子的活性。结果表明,家蚕CIb1基因启动子在BmN细胞中有微弱的转录活性;野生型BmNPV感染能增强启动子活性;hr3增强的不同长度CIb1基因启动子片段的活性有显著差异,提示转录起始位点上游-74～-1nt包含了启动子的基本元件,而在-687～-465nt、-465～-317nt和-317～-74nt存在着主要的顺式元件。试验结果有助于阐明CIb1的表达调控机理和对家蚕天然性免疫的理解。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒对家蚕核多角体病毒在蚕体内复制的干扰

昆虫杆状病毒具有相对狭窄的宿主域.虽然苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)两者DNA序列的同源性在95%左右,但AcMNPV不能在家蚕细胞中很好的复制,对家蚕幼虫不具有致病能力,但其基因组中个别基因可在被接种该病毒的家蚕幼虫体内表达.这些基因的表达可能对共感染的优势病毒BmNPV复制所需原料蛋白及转录因子形成竞争,进而抑制BmNPV在家蚕幼虫体内的复制表达.     

基于2b-RAD技术的家蚕BmNPV抗性关联基因的全基因组筛查

不同家蚕品种对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的抵抗性存在较大差异,家蚕抗性品系AN、野BN对Bm NPV侵染具有较强的抵抗性。用易感家蚕品系C108分别与AN和野BN杂交、回交,构建两个抗性品系的BC3M和BC4M分离群体,利用简化基因组测序技术2b-RAD(基于IIB型限制性内切酶的RAD)进行亲本和杂交分离群体的基因组测序,通过生物信息学方法筛选位于染色体上与抗性相关的多态性SNP标记,进行抗性品种的基因型分析。对3个亲本及2个抗性分离群体样本基因组DNA构建的2b-RAD标签文库进行Illumina测序,获得抗性亲本AN、野BN的多态性SNP标记11 919个和12 293个。对抗性分离群体全基因组染色体的Bm NPV抗性关联SNP标记指数(SNP-index)进行分析,结果表明亲本品系AN、野BN的Bm NPV抗性相关SNP标记分布在多个染色体上,其中AN的全基因组中抗性贡献率前5位是第5、10、27、23和4号染色体,野BN的全基因组中抗性贡献率前5位的是第4、27、15、18和6号染色体,有多个SNP-index高值位点与已知Bm NPV抗性相关基因的位置具有较高的一致性。推测AN、野BN两个品系的Bm NPV高抗性与抗性主基因和其他抗性基因的联合作用有关。     

家蚕核型多角体病毒的离体增殖

<正> 关于家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)已是研究较为深入的一种杆状病毒。家蚕细胞系统是研究病毒与宿主相互关系,病毒的特异性,病毒基因表达的理想实验材料。最令人感兴趣的是:这一材料已发展成为表达外源基因的载体宿主系统。目前国内正积极利用该材料,从事各种研究。系统地研究BmNPV在离体细胞中的复制增殖,特别是在较大规模培养细胞水平探索病毒增殖规律方面,对于进一步开发应用这一病毒资源,拓宽其应用价值是十分重要的。本文在静止培养70毫升细胞规模下,研究了BmNPV的离体增殖及其特征。     

表达短lef-1dsRNA转基因家蚕对BmNPV的抵抗能力与主要经济性状

为了提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗能力,将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入家蚕卵,经G418和GFP双重筛选并结合分子生物学鉴定,证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄幼虫接种BmNPV,结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕(对照组)下降了10～30个百分点,表明转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高;对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示,2个系统体内的lef-1 mRNA转录水平比对照组平均降低了72倍和26.5倍,最高下降了104倍,进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPV lef-1基因的表达。转基因家蚕的饲养成绩显示其全茧量、茧层量和茧层率等主要经济性状与正常家蚕无明显差异。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

干涉BmNPV极早期非必需基因ie-2的转基因家蚕系统构建和抗性检测

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是严重危害家蚕的病原之一。为了探究通过转基因干涉BmNPV非必需基因抑制病毒的增殖,提高家蚕抗性的可行性,选择BmNPV极早期非必需基因ie-2作为靶标,构建转基因干涉载体,通过显微注射获得转基因家蚕系统A4Pie2H-A和A4Pie2H-B。3龄幼虫添食感染BmNPV后,A4Pie2H-A与A4Pie2H-B的幼虫死亡率分别比非转基因对照品种降低19%和24%;定量PCR结果显示A4Pie2H-A与A4Pie2H-B的幼虫体内的ie-2 mRNA表达量分别为非转基因对照品种的50%和20%,病毒DNA含量分别为非转基因对照品种的32%和12%。此外,2个转基因家蚕系统的全茧量和茧层率与正常家蚕品种比较无显著差异。研究结果表明,干涉BmNPV极早期非必需基因ie-2可以显著抑制转基因家蚕体内病毒的复制增殖,使幼虫死亡率降低。     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。