番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PCR检测技术体系的检测灵敏度比普通PCR高1 000倍。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子中Pst的带菌量,检测下限为4.21 cfu·g^-1;检测人工接种叶片组织中Pst的带菌量,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×102 cfu·g^-1。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR、普通PCR和病原菌分离检测,检测到54个样本中含有Pst,3种方法检测结果一致。结果表明,建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测番茄种子和发病组织中Pst的含量,为番茄细菌性斑点病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。     

番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

番茄细菌性溃疡病菌的定性PCR检测方法

以2个番茄溃疡病菌株和其它6种植物病原菌为试验材料,以micA、cytC、TomA等3个特异性基因为检测靶标,采用检测引物设计与优化、特异性测试、灵敏度测试等方法,研究建立番茄溃疡病菌的定性PCR检测方法。结果表明:依据这3个基因建立的PCR检测方法可特异、精准检测番茄溃疡病菌,其中,以TomA基因为检测靶标的方法灵敏度可达到5copy/μL或103 cfu/mL,优于另外2种方法,为番茄溃疡病菌的早期诊断提供了快速、准确的技术手段。     

西瓜枯萎病菌PCR分子检测方法研究

【目的】西瓜枯萎病是一种严重危害西瓜生产的世界性土传真菌病害,快速及时地检测出西瓜枯萎病菌,对西瓜枯萎病的早期监控预测及后期防治具有重要意义。【方法】利用镰孢属尖孢镰刀菌基因组的数据库,设计筛选西瓜枯萎病菌的特异引物,基于普通PCR技术建立快速简便的分子检测体系,对接种过的西瓜植株和土壤进行检测验证。【结果】该引物可获得556 bp的特异性扩增片段,体系的灵敏度为365 pg·μL~(-1)。利用PCR检测体系对感病西瓜植株和土壤进行检测,结果显示在抗感品种接种1～5 d后都能检测到西瓜枯萎病菌,而此时植株没有病症,后期检测到的病菌量与其病情指数有一定的相关性;检测接种过的土壤的灵敏度为5×102cfu·g~(-1),而在此密度的病菌土壤中,西瓜植株的发病株率较低。【结论】建立了一套基于普通PCR技术分子检测体系,可用于感病植株和土壤的西瓜枯萎病菌快速及时检测,为指导西瓜枯萎病的早期预测以及制定综合防治措施提供重要的参考依据。     

杏鲍菇枯萎病菌PCR检测方法的建立与初步应用

以杏鲍菇枯萎病菌侧耳泛菌(Pantoea pleuroti)为试材,采用PCR引物设计的方法,通过分析P.pleuroti基因组的测序结果,设计合成并筛选出可检测P.pleuroti的引物,并研究其检测效果,以期建立P.pleuroti的高效PCR检测体系,并为科学防控杏鲍菇枯萎病提供分子基础。结果表明:K3143F/R和K37F/R 2对引物特异性强,仅P.pleuroti基因组DNA作为模板时,PCR扩增产物分别呈现1条660 bp和1条666 bp的特异性条带,15株Pantoea属细菌和3株食用菌常见病原菌的基因组DNA及阴性对照作为模板扩增产物均无条带;基于这2对引物建立的检测体系均不受杏鲍菇组织液的干扰,灵敏度高,可检测出最低3.6 pg·μL^-1的P.pleuroti基因组DNA;应用这2种体系对接种P.pleuroti 48 h后的杏鲍菇样品进行了检测,最低可检测出子实体内100 cfu的杏鲍菇枯萎病菌;此外,整体上,引物K3143F/R比K37F/R的检测效率更高。     

甘肃地区番茄细菌性斑点病菌的鉴定与检测

从番茄病果上分离纯化的细菌菌株,经致病性测定、形态特征、培养特性观察及16S rDNA
序列测定,鉴定为番茄细菌性斑点病菌Pseudomonas syringae pv. tomato（Okabe）Young,Dye et Wilkie。
利用特异性引物对已鉴定菌株及番茄发病组织进行PCR 扩增,均扩增出530 bp 左右的特异性片段,印证
了可利用特异性引物MM5F/MM5R 对分离菌株或番茄发病组织进行PCR 扩增以检测番茄细菌性斑点病菌。     

利用实时荧光PCR 方法检测香蕉软腐细菌

 由Dickeya spp.引起的香蕉细菌性软腐病是近年来在中国广东发生的一种严重危害香蕉的病 害,检测方法的建立和应用是防止病害传播和实时防治的重要手段。依据报道的Dickeya spp.通用引物, 建立了用于香蕉细菌性软腐病发病植株和带菌土壤检测的实时荧光PCR 方法。优化后的检测体系对香蕉 软腐细菌（XJ8-3-3）靶片段克隆质粒DNA 的检测灵敏度可达到2.4 × 10^-5 ng · μL^-1,对菌悬液的检测灵敏 度可达到4.0 × 10² cfu · mL^-1,而常规PCR 对其检测的灵敏度为2.4 × 10^-3 ng · μL^-1 和4.0 × 10⁴ cfu · mL^-1, 实时荧光PCR 的灵敏度比常规PCR 高100 倍。利用实时荧光PCR 能够快速的检出香蕉细菌性软腐病发 病植株和带菌土壤中的病原菌量,对梯度稀释的菌悬液接种的带菌土壤检测结果表明,可检测到病菌DNA 最低含量为0.35 pg · L^-1。该方法适用于对香蕉软腐病菌的检测和监控。     

杜鹃花枯萎病菌TaqMan MGB探针实时荧光快速检测方法

根据杜鹃花枯萎病菌(Ovulinia azaleae)及其近似种ITS基因序列差异,设计合成1对特异性引物和1条Taq Man-MGB探针,建立了杜鹃花枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测杜鹃花枯萎病菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为10μL反应体系中总DNA含量0.25 pg;实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似携带杜鹃花枯萎病菌样品的检测与初筛。此方法快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后处理,为杜鹃花枯萎病菌早期诊断检测提供了重要参考。     

番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。     

猕猴桃溃疡病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为建立猕猴桃溃疡病PSA病原菌的实时荧光定量PCR方法,根据hrpW基因设计一对引物P3F/P5R,扩增片段大小为247bp,构建该片段的阳性质粒用于荧光定量PCR标准曲线的制作;评价引物的灵敏度、特异性,并验证其实际应用效果。结果表明,该方法能特异性地检测出PSA病原菌,灵敏度为100fg/μL。以采集的无病症和有病症猕猴桃枝条为样品,本方法可检测到无病症枝条中最低浓度为8.45×10-5 ng/μL的PSA病原菌。本实验建立的实时荧光定量PCR检测猕猴桃溃疡病菌方法可用于猕猴桃溃疡病感病样品的早期诊断,对该病原菌的预防诊治具有重要意义。     

苹果锈果类病毒实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立苹果锈果类病毒(ASSVd)检测灵敏的方法。【方法】根据Gen Bank中ASSVd的RNA序列设计特异性引物ASSVd-F和ASSVd-R,利用实时荧光PCR方法对其进行检测,并对体系的特异性、灵敏性及适用性进行验证。【结果】实时荧光PCR体系能检测至1×10-6的模板浓度,而常规RT-PCR只能检测至1×10-4,由此可知,实时荧光PCR体系灵敏度高于常规RT-PCR 100倍;引物特异性强,能特异检测ASSVd,对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)均不能检出;适用性广,可检测出植物不同部位的ASSVd。【结论】所建立的方法能够灵敏检测ASSVd,特异性强,适用性广。     

樱桃番茄病害的综合防治措施

1樱桃番茄茎腐病1.1症状：茄病镰孢引起的茎腐病,初症状不明显,持续一段时间后,番茄植株呈枯萎状,茎基部产生褐色至深褐色略凹陷斑,向上下及四周扩展,当扩至绕茎1周时,出现枯萎状,与枯萎病相似。番茄小双胞腔菌侵入番茄后引起茎叶产生褐斑。     

平菇细菌性褐斑病病原菌RT-PCR检测方法的建立及其应用

 平菇细菌性褐斑病是一种严重危害平菇生产的病害,早期监测和防治是关键。采用平菇细菌性褐斑病病原菌托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii）毒素基因的特异性引物（Pt-1A）/（Pt-1D1）,通过扩增条件优化,建立了该菌的实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction）检测及富集方法,并利用该方法完成了该菌在平菇表层的动态监测。试验结果表明,实时荧光定量PCR对托拉斯假单胞杆菌的检测范围为10² ~ 10⁹ cfu ? mL^-1,在经过选择性培养基富集后,检测灵敏度进一步提高了100倍。利用选择性培养基富集及荧光定量PCR检测方法,可在病害症状未显现之前检测到病原菌,为平菇细菌性褐斑病的流行监测和早期防治奠定了技术支持。     

寿光设施番茄尖孢镰刀菌的分离、鉴定及番茄品种感病研究

从山东省寿光市温室、大棚发病番茄植株上分离纯化获得18个菌株（SG1～SG18），通过柯赫氏法则验证菌株致病性，并结合形态学、分子生物学等方法对菌株进行鉴定。结果表明：分离纯化的病原菌均为尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici），所引起的病害为番茄枯萎病。其中菌株SG6、SG7、SG17为番茄枯萎病菌生理小种1，其余菌株为番茄枯萎病菌生理小种3。不同番茄品种接种3个番茄枯萎病菌生理小种的盆栽试验结果表明，釜山88是比较典型的番茄枯萎病菌3个生理小种的易感病品种，圣安妮和草莓番茄是适合寿光地区栽培的较抗番茄枯萎病品种。     

番茄枯萎病菌分离鉴定及嫁接砧木抗病性评价

从河北省番茄栽培面积较大的定兴和肥乡地区枯萎病病株中分离纯化菌株,通过形态学和分子生物学等方法对病原菌进行鉴定,并采用浸根法鉴定了10个番茄砧木的枯萎病抗性。结果表明,从定兴和肥乡分离到的菌株均为尖孢镰孢菌,采用尖孢镰孢菌生理小种特异性引物进行PCR扩增,证明2个菌株都为尖孢镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)生理小种3;筛选得到了3个枯萎病高抗砧木品种,7个抗病砧木品种。     

苦瓜枯萎病病原的鉴定及植株体内菌量测定

从福建省福州市的苦瓜枯萎病病株上分离到19个镰刀菌菌株,经Booth镰刀菌鉴定方法及尖孢镰刀菌特异性引物(FOF1/FOR1)PCR鉴定,确定19个菌株均为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。将该菌株回接健康苦瓜幼苗,植株表现枯萎症状,重新分离又获得相同的病原物。采用分段取不同病株样本的方法研究了该菌在植株体内的数量分布,结果表明无症植株、中度病株和重度病株体内均存在尖孢镰刀菌,无症植株含菌量最低,中度病株含菌量最高,重度病株含菌量次之,但均表现为茎基部含菌量最高,根部次之,茎中部则低于根部,茎顶部和叶片均未分离到病原菌。     

利用免疫磁性分离–PCR检测安祖花细菌性枯萎病病原菌

 根据地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae）的RAPD序列设计特异性引物,并对羧基化磁珠的结合性能进行检验,从而建立和优化了免疫磁性分离–PCR体系,对安祖花细菌性枯萎病进行早期检测。结果表明：1 mg磁珠对多克隆抗体最大吸附值为0.268 mg,进行免疫磁性捕获时免疫磁珠的最佳浓度是0.566 ~ 0.741 mg ?mL^-1。免疫磁性分离–PCR可以减少PCR反应中的抑制物质,对X. axonopodis pv. dieffenbachiae的检测灵敏度可以达到10 ~ 100 cfu ?mL^-1,比常规PCR检测灵敏至少100倍。     

甜瓜内源病毒CmEV的TaqMan RT-qPCR检测方法研究

甜瓜内源病毒(cucumis melo endornavirus,Cm EV)是近年来发现的寄主广泛、发病率高、种传率高的重要病毒。利用Cm EV基因组的序列信息设计特异性引物和探针,建立基于探针法的实时荧光定量PCR(Real-Time Fluorescent Quantitative PCR with Taq Man probes,Taq Man RT-q PCR)的检测方法。该方法可以检测出1×10^-2 ng·μL^-1的RNA和1.8×10³ copies·μL^-1的质粒,灵敏度是普通PCR的100倍。利用该方法检测了在北京、山东、辽宁、海南瓜类种苗主产区的甜瓜、西瓜、黄瓜与南瓜砧木11份种苗带毒情况,发现山东和海南各有1份甜瓜种苗携带Cm EV。本研究建立的CmEV TaqMan RT-q PCR方法特异性好、灵敏度高,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。     

多主棒孢SdhB-H278Y突变位点real-time PCR检测体系的建立与应用

根据Gen Bank已登录序列中黄瓜多主棒孢琥珀酸脱氢酶B亚基(Sdh B)基因序列差异，针对Sdh B-H278Y突变设计特异性引物，建立Sdh B-H278Y突变实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系。结果表明：供试多主棒孢携带Sdh B-H278Y、Sdh B-I280V突变；Sdh B-H278Y突变株对啶酰菌胺抗性较强，EC₅₀值为21.47μg·m L^-1或>30μg·m L^-1；建立的real-time PCR检测体系具有良好的线性关系，相关系数R²=0.992 9，可特异性检测Sdh B-H278Y突变，灵敏度为3.6×10^-4ng·μL^-1，为AS-PCR的10倍。利用携带Sdh B-H278Y突变不同比例的基因组DNA对检测体系进行验证，预期值与检测值具有很高的相关性，R²=0.999 7；利用该检测体系对山东地区黄瓜棒孢叶斑病病斑中多主棒孢Sdh B-H278Y突变株所占比例进行检测，检测...     

香蕉枯萎病菌热带4号小种对番茄等3种模式植物的致病性分析

香蕉遗传转化体系效率低,难以满足大量鉴定基因的抗性功能的要求。为了借鉴模式植物成熟的遗传转化再生体系,对拟南芥、烟草、番茄3种模式植物的多个常用品种材料对强毒性香蕉枯萎病菌热带4号小种的敏感性进行评价。结果表明,仅番茄‘Money Maker’品种受侵染后表现出典型的枯萎病症状;从感病植株根颈附近茎段内部坏死组织可检测和再次分离出病原菌,说明病菌的致病性符合柯赫氏法则（Koch’s Rule）。进而以子叶为外植体建立了高效的Money Maker番茄不定芽再生体系。研究结果为借助模式植物番茄进行快速筛选鉴定抗香蕉枯萎病功能基因奠定了基础。