家蚕2龄不眠蚕突变体的发现及遗传特性分析

在家蚕品种C603中发现了一种新的不眠蚕突变体。该突变体幼虫在2龄将眠初期体表有光泽,但进食量减少,蚕体基本不发育,且持续6~8 d仍然不能入眠和蜕皮,不能正常发育至3龄期,并终因体能耗尽陆续死亡。将该突变体命名为2龄不眠蚕(non-molting at the 2nd instar,nm2)。遗传分析显示,正常情况下发生突变体的蛾区中正常型个体与突变个体的比例约3∶1,有纯合致死现象,因此认为该突变体受1个隐性单基因控制。但是,不同季节饲养该突变系统出现的性状分离比不太稳定;与正常型品种杂交的F2、BC1F和BC1M世代其突变性状分离比率远低于25%。2龄第2天添食蜕皮激素能拯救2龄不眠蚕向正常发育转变,但不能改变不眠蚕的遗传特性。在nm2突变体检测到蜕皮激素合成相关基因cyp307a2的表达,而在与该突变体表型相似的nm-g突变体中未检测到该基因的表达,因此判断nm2是一个新的突变体,并初步推测蚕体内蜕皮激素水平低是nm2突变体产生的重要生理因素。     

细胞周期素家族基因在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中的转录特征

细胞周期蛋白(cyclin)是真核生物细胞有丝分裂的重要调节蛋白,家蚕具有5种类型细胞周期蛋白基因。以4龄将眠蚕、4龄眠蚕和5龄起蚕为材料,采用定量PCR方法分析5种细胞周期蛋白基因在4龄幼虫蜕皮过程的组织表达特征为:5种类型cyclin基因在生殖腺中都高表达,其中cyclinE在眠中表达量最高,其它4种类型cyclin基因在将眠时表达量最高,证实4龄眠期是家蚕生殖腺细胞发生有丝分裂的重要时期;5种类型cyclin基因在马氏管中都有表达,其中cyclinA和cyclinB3在4龄将眠蚕的马氏管中存在表达高峰,推测和马氏管内表皮更新相关;除cyclinL1在眠蚕丝腺的表达量很低外,cyclinA、cyclinB、cyclinB3和cyclinE在眠蚕丝腺中都存在表达高峰,可能和丝腺的内表皮更新相关;cyclinA、cyclinB、cyclinB3在脂肪体中的表达量较高,且在将眠时或眠中存在表达高峰,推测和脂肪体中能量物质的积累相关;5种类型cyclin基因在脑、血液和中肠的表达量都很低,且蜕皮前后的变化规律不明显。研究结果提示:在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中,cyclin基因的转录特征不仅和来源于外胚层组织的表皮更新相关,还和生殖腺的发育及脂肪体中能量物质的积累存在相关性。     

昆虫眠性调控相关基因的研究进展

入眠是昆虫幼虫生长发育过程中非常重要的一种生理现象,其入眠蜕皮过程主要包括促前胸腺激素(PTTH)介导的蜕皮激素合成、蜕皮激素介导的信号转导和最终皮层溶离及色素沉积3个阶段,是一个复杂的生理过程,受到许多因素的影响,其中蜕皮激素和保幼激素等因素的影响较为显著。基于此,本文论述了蜕皮激素信号通路相关基因、保幼激素合成与代谢相关基因、相关神经肽基因及其他相关基因对昆虫眠性的影响。通过对这些基因进行综述,可以为系统研究家蚕等昆虫入眠蜕皮过程中的生理生化反应提供理论依据,对昆虫生长发育和生殖的研究以及农林害虫防控都有十分重要的意义。     

家蚕丝蛋白基因在不同发育时期表达量的变化

本文采用半定量RT-PCR方法,检测了家蚕4～5龄期丝腺中5个丝蛋白基因(Fib-H、Fib-L、Ser-2短片段、Ser-2长片段、Ser-3)在不同发育时期表达量的变化。结果表明,Fib-H、FIB-L及Ser-3基因的表达规律相似,总体上4龄期表达量明显低于5龄,但4龄眠期均有明显表达,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,至熟蚕或熟蚕后2d达到高峰,此后迅速下降;Ser-2基因两个转录本的表达规律基本一致,与以上3个基因相比,Ser-2基因在4龄期存在相对较高的表达量,但在4龄眠期表达量明显降低,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,Ser-2短片段和长片段分别从5龄96h和144h之后表达量开始降低,到熟蚕期基本达到最低值。     

蜕皮激素诱导家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达变化

昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。     

外源蜕皮激素和保幼激素类似物对家蚕丝腺蜕皮激素受体基因表达活性的影响

为了进一步探讨外源蜕皮激素（Moulting hormone,MH）和保幼激素类似物（Juvenile hormone analogue,JHA）处理家蚕的增丝机理,本试验分别于5龄24h注射植源性MH和5龄72h注射JHA,采用半定量RT-PCR方法,测定了蜕皮激素受体（ecdysone receptor,EcR）（BmEcR-B1型）基因在家蚕5龄不同发育时期在中部丝腺和后部丝腺中表达量的变化。结果表明,正常对照家蚕丝腺中,EcR基因的表达均在5龄前期表达量较低,中后期表达量较高,但丝腺不同部位,表达模式不同。5龄24h用MH处理后,无论是中部丝腺还是后部丝腺,EcR基因的表达活性与对照组相比,总体上均是先上调后下降;而5龄72h用JHA处理,EcR基因的表达一直到对照熟蚕前均低于对照区;但两种处理区在对照区熟蚕之后仍有不同程度的表达。说明外源激素可通过影响MH受体基因的表达,从而影响了MH信号转导,进一步影响丝蛋白的合成。     

家蚕黑色蚕突变体p~B中apontic-like基因的结构与表达分析

黑缟蚕(striped,p~S)突变体是由p基因座上的一个等位基因控制的色素沉积突变体,经图位克隆发现是由apontic-like(apt-like)基因控制的。控制黑色蚕突变体(black,p~B)的主效基因和控制p~S的主效基因是等位基因,为了验证黑色蚕突变体p~B是否也是apt-like基因突变引起的,以黑色蚕突变体(p/p~B)和野生型素蚕(p/p)为试验材料,对apt-like基因在p~B和p中的结构和表达进行了分析,结果表明,apt-like基因编码序列在p~B(p/p~B)和p(p/p)中没有差异,在基因组上克隆验证亦无差异。实时定量PCR表达量检测结果表明,apt-like基因在检测过的5龄第3天幼虫头部、表皮、中肠、血淋巴、卵巢、精巢、马氏管、气管、丝腺和脂肪体中均有表达,其中在头部、表皮和中肠的表达量较高;且除血淋巴外,在其他9个组织中在p中的表达量显著高于在p~B中的表达量,表明apt-like基因对p~B突变性状的形成起重要作用。该研究结果将为进一步研究apt-like基因功能及其在p~B突变体中所起的作用提供理论依据。     

一种适于研究家蚕色素代谢的眠蚕体壁组织培养方法与黑色素合成抑制试验

利用家蚕幼虫眠时形成新表皮以及重新合成黑色素分布于新表皮上形成固有体色斑纹等特点,用4龄入眠后的家蚕幼虫体壁组织为材料,观察离体培养体壁的色素代谢变化,探索适宜的家蚕幼虫体壁培养基及培养温度条件,眠蚕体壁的取材方法及取材时间,色素代谢观察的外观标志性状等。实验结果表明:含10%优等胎牛血清的Grace培养基适于家蚕幼虫体壁组织培养,培养温度为26℃;取4龄期入眠11～12 h后剥去旧表皮的体壁组织更容易观察色素代谢的外观性状变化;体壁培养24 h后,刚毛再生和色素沉积是易于观察的色素代谢变化标志性状。通过对家蚕4龄眠蚕离体培养体壁组织的黑色素合成抑制试验,观察到体壁外观性状变化,证明酪氨酸羟化酶催化酪氨酸转化成多巴是家蚕黑色素合成代谢途径中的一个重要环节。     

家蚕幼虫蜕皮前后头胸部蛋白质的差异表达分析

家蚕(Bombyx mori)属于完全变态昆虫,其幼虫需要经历3~4次入眠蜕皮才能结茧化蛹,已明确蜕皮过程受控于蚕体内蜕皮激素和保幼激素的含量,2种激素分别由位于头胸部的前胸腺和咽侧体分泌。为了从蛋白质水平解析家蚕蜕皮调控机制,应用双向电泳(2-DE)技术分别对各个龄期的将眠蚕、眠蚕和起蚕头胸部的总蛋白质进行分离,再以基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)对差异蛋白点进行鉴定。对各时期幼虫头胸部总蛋白质的2-DE图谱比对,共发现9个在眠期上调表达的差异蛋白点,经质谱鉴定分别为富含亮氨酸的损伤DNA结合蛋白、含有DEAD/H结构域的SWI/SNF相关的核小体重塑调节因子、精子生成相关蛋白、呼吸相关蛋白和泛素蛋白连接酶。初步推断这些差异表达蛋白不仅分别在家蚕的生理代谢、细胞凋亡、生殖发育、生长调节等生物学过程发挥作用,而且在幼虫的蜕皮过程中扮演了重要角色。     

药物诱变三眠蚕的激素分泌器官显微和超微结构变化

用“金鹿三眠素”一类的生物活性化学物质添食早龄家蚕幼虫,可人为地诱导成三眠蚕,这可能是由于该类化学物质有抑制家蚕幼虫咽侧体分泌保幼激素及加速蚕幼虫脑发育、提前分泌脑激素(促前胸腺激素),促进前胸腺合成释放蜕皮激素所致。本研究观察到药物诱导而成的三眼熟蚕的脑和前胸腺体积均比对照组相同经过时间的正常四龄三日蚕大,与后者相比较,前者前胸腺的内质网较为发达,游离核糖体也较为丰富,而与正常五龄熟蚕的情况很相似,表明药物诱导三眠熟蚕前胸腺细胞内的合成和分泌活动很旺盛。本观察研究结果与上述推测“金鹿三眠素”一类化学药物的作用机理相一致。     

昆虫外源激素对家蚕生长发育的影响及其相互关系的研究

用昆虫保幼激素(JH),蜕皮激素(MH)和抗保幼激素(AJH)给家蚕添食、体涂或注射,进行调控其生长发育的试验。结果表明:(1)2龄、3龄和4龄蚕应用外源激素处理,AJH与MH之间存在明显的拮抗关系;而AJH与JH间未表现出拮抗关系。(2)第5龄蚕应用外源激素处理,JH与MH间的拮抗关系明显。(3)AJH(YA_(20))对家蚕生长发育的影响,主要表现为抗蜕皮激素和类似保幼激素的生理效应。在第4龄添食AJH诱导3眠蚕的情况下,利用JH延长3眠蚕的龄期经过,是提高3眠蚕茧丝产量的技术途径之一。     

家蚕蜕皮激素22激酶2(BmEcK2)的序列及基因表达特征分析

前期研究发现在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,Bm CPV)的家蚕幼虫中肠中,有一个下调表达的差异蛋白可能参与了家蚕对Bm CPV感染的抵抗过程。利用Blastp进行同源性比对的结果显示,该蛋白质与尺蠖(Operophtera brumata)的未知蛋白质OBRU01_04785和蜕皮激素22激酶(Ecdysteroid 22-kinase)的序列相似度分别为51%、49%,进一步通过多序列比对和系统进化分析发现该蛋白质与Ecdysteroid 22-kinase蛋白的亲缘关系最近,属于蜕皮激素激酶超家族;该蛋白质与家蚕中已知的蜕皮激素22激酶1(Bm Ec K1)的序列相似度为24.4%,因此将其命名为Bm Ec K2。实时荧光定量PCR检测Bm Ec K2基因m RNA在家蚕5龄幼虫中肠组织中的转录水平最高,其次是马氏管、丝腺和卵巢,而在血淋巴、头部、精巢、脂肪体中几乎检测不到转录;家蚕5龄起蚕感染Bm CPV后24、48、72 h,中肠中Bm Ec K2基因m RNA的转录水平下调,分别是对照组家蚕中肠的0.32、0.45和0.21倍。研究结果初步提示,Bm CPV感染导致家蚕中肠中的Bm Ec K2下调表达,进而可能影响到家蚕体内激素调节水平的变化。     

家蚕类钙粘蛋白BtR-175基因敲除突变体创制和抗性检测

家蚕类钙粘蛋白BtR-175不仅是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)晶体毒素蛋白的受体蛋白,也是黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombysepticus)晶体毒素蛋白的受体分子。为建立对黑胸败血芽孢杆菌具有抵抗能力的家蚕品系,采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术,设计引导RNA(gRNA)对家蚕BtR-175基因进行精确定点编辑,对蚕卵显微注射重组质粒pU C57-hA 4-Cas9和T-U6-BtR-175后,筛选获得2个碱基插入导致蛋白质翻译提前终止的BtR-175基因敲除突变体,命名为ΔBtR-175。4龄起蚕经口添食黑胸败血芽孢杆菌,结果ΔBtR-175突变体家蚕的死亡率为34.4%±5.8%,野生型家蚕的死亡率为57.8%±8.4%,表明ΔBtR-175对黑胸败血芽孢杆菌的侵染抵抗性显著提高。饲养试验显示ΔBtR-175突变体和野生型家蚕的茧层量没有显著性差异。该突变体有望进一步培育为家蚕抗性育种素材。     

家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的诱导表达模式及蜕皮激素响应元件核心保守区的识别

核受体基因家族是介导昆虫蜕皮激素(20E)作用的关键信号分子。为了研究家蚕丝腺中核受体异源二聚体编码基因——蜕皮激素受体基因Bm EcR和超气门蛋白基因Bm USP的表达模式,应用实时荧光定量PCR技术检测家蚕5龄幼虫正常状态下和用2×10~(-3)μg/μL蜕皮激素处理后Bm EcR与Bm USP在丝腺组织中的表达变化。结果表明,20E处理后,Bm EcRA、Bm EcR-B1和Bm USP在中、后部丝腺的表达量与对照组相比均有不同程度增加,说明20E能够促进Bm EcR-A、Bm EcR-B1和Bm USP基因的表达;但中部丝腺与后部丝腺Bm EcR-A、Bm EcR-B1和Bm USP基因的表达变化趋势不同。利用等温滴定量热技术(ITC)获得的家蚕蜕皮激素受体结构域蛋白Bm EcR-B1D与蜕皮激素响应元件Bm E75A-EcRE及其缺失突变体相互作用的亲和力常数(K)、反应热(ΔH)和熵(ΔS),显示了Bm EcR-B1D蛋白能够与Bm E75A-EcRE进行结合,并发现Bm E75A-EcRE的核心保守区为编码序列TCTTC,推测该区域有可能是Bm EcR-B1D蛋白结合在Bm E75A-EcRE上的精确位点。     

BmLSP基因启动子驱动DsRed在转基因家蚕中的表达分析

家蚕幼虫血清蛋白(BmLSP)是由脂肪体细胞合成的一种贮藏蛋白,是研究家蚕幼虫期发育调控的理想靶标。基于家蚕基因组数据,克隆了BmLSP基因5'端侧翼区～1.6 kb的调控序列,构建成以红色荧光蛋白基因DsRed为报告基因的pig-gyBac表达载体并进行转基因注射,在个体水平上验证该启动子的特性。结果表明:BmLSP-DsRed表达框以单拷贝形式整合至家蚕基因组;DsRed在转基因家蚕脂肪体中特异转录表达,其时期表达特征与BmLSP基因基本一致,随发育阶段的不同呈现有规律的变化,即幼虫期表达,但1龄、2龄眠期不表达,3龄、4龄眠期有微弱表达,上蔟后表达量逐渐降低直至化蛾阶段消失。提示BmLSP可能通过其启动子区的特异元件受激素的精确调控而行使功能。     

为什么早熟蚕中多蝇蛆病?

蚕蛆蝇寄生的五龄蚕往往早熟,这首先需要简述一下控制蚕的眠和变态的三种激素,即:脑激素、蜕皮激素和保幼激素。脑激素由脑内的神经分泌细胞分泌,能激活前胸腺,促使分泌一种引起就眠蜕皮的蜕皮激素。每次蜕皮时由真皮细胞分泌的新皮,是哪样的皮?则决定于第三种激素,即由咽侧体分泌的保幼激素。当存在保幼激素时的幼     

影响家蚕表达外源基因效率的几个重要因子的比较研究

本研究以重组病毒rSj14NPV为感染病毒,通过比较纯化蛋白的产量,对家蚕作为生物反应器生产基因工 程产品的适宜蚕品种与相关的重组病毒接种技术进行了比较研究。研究结果表明:871×872、秋风×白玉为表达 Sj14的适宜蚕品种;重组病毒接种量与蛋白表达量有关,适宜接种量为4～5μL/蚕;适宜接种时间以5龄2日龄为 优;以家蚕表达外源基因,最好将重组病毒以家蚕细胞复苏后再接种家蚕以保证获得较高的表达效果。     

Hippo信号通路对家蚕体壁发育和细胞增殖的调控

Hippo信号通路最早是在果蝇中发现的,在组织器官的发育调控中起重要作用,信号通路中的一些基因还被鉴定为肿瘤抑制基因。这个信号通路在果蝇和小鼠中得到广泛关注,但是在家蚕中关注甚少。西南大学的LIN等人在家蚕中鉴定了Hippo信号通路的主要相关基因(Hippo,Salvador,Warts,Mats,Yorkie)并命名为BmHpo,BmSav,BmWts,BmMats,Bm Yki。这些基因在家蚕和其他生物中高度保守,说明它们通过相似的蛋白质相互作用建立Hippo信号通路。研究中分析了这些基因在家蚕胚胎,幼虫、游走期、蛹期及蛾期的时期表达模式,以及在幼虫5龄3天的14个组织中的组织表达情况。研究结果表明Hippo信号通路对家蚕的发育是有影响的。为了了解Hippo信号通路调控家蚕发育的分子机制,作者在家蚕卵巢细胞系(BmN-SWU1,NS)中分别上调和下调表达了BmHpo和BmYki基因,发现细胞增殖活性和细胞周期发生了改变。该研究发现Hippo信号通路的基因在家蚕表皮发育及细胞增殖方面有重要作用。     

诱导家蚕3眠化、生产超细生丝的制剂

应用蜕皮激素与保幼激素来调控家蚕营茧时间,不但早已为人们所利用,而且还查明了上述激素之所以起作用的决定性物质是咪唑类化合物。最近,由日本蚕丝·昆虫农业技术研究所、千叶县农业试验场、日本农产工业株式会社、日本烧碱株式会社4家合作研制的诱导家蚕3眠化的制剂,解决了过去生产超细生丝不稳定的难题。这一技术于1997、1998年经26个县的试验研究机构验证,确认了该制剂在促进家蚕3眠化技术上的有效性:(1)应用该制剂,能使普通4眠蚕全部3眠化。(2)在3龄蚕的人工饲料上添加本制剂,亦能达到3眠化。(3)在3龄起蚕后的48小时内,给饲含本制剂的…     

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。