Pt-CaM基因克隆及对菌核侧耳耐热性影响

通过保守序列比对、cDNA末端快速扩增技术和融合引物巢式PCR技术克隆菌核侧耳（Pleurotus tuber-regium）钙调蛋白（calmodulin,CaM）基因Pt-CaM。基因全长856bp,cDNA全长477bp,编码158个氨基酸。构建Pt-CaM的过表达和干涉载体,利用根癌农杆菌转化技术成功转化至菌核侧耳菌丝体中。在38℃高温培养下,过表达转化子的菌丝较野生型更致密,热激蛋白（heat shock protein）HSP70的表达量为野生型的3.89倍,超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）的活性为野生型的2.49倍和1.83倍;与野生型相比,干涉转化子菌丝生长速率降低,热胁迫损伤加重,其HSP70的表达量为野生型的0.77,SOD和CAT的活性无差别,过氧化物酶（peroxidase,POD）的活性为野生型的0.7。结果表明Pt-CaM可能通过影响HSP70的表达量和SOD、CAT和POD的活性参与菌核侧耳菌丝的耐热性调控。     

糙皮侧耳凝集素基因Plectin的克隆和表达分析

基于cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了两个糙皮侧耳凝集素基因Plectin1和Plectin2。结构分析显示Plectin1和Plectin2基因全长分别为1 371和1 359 bp,二者均含有5个外显子和4个内含子;Plectin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,Plectin2开放阅读框长1 122 bp,编码373个氨基酸。Southern杂交试验证实Plectin1和Plectin2在糙皮侧耳基因组中均只有1个拷贝。利用qRT-PCR分析了Plectin1和Plectin2在糙皮侧耳不同生长阶段的表达量,结果显示Plectin1和Plectin2分别在成熟子实体阶段和幼嫩子实体阶段表达量最高,这表明Plectin1和Plectin2基因可能在糙皮侧耳子实体生长发育中起到一定的调控作用。     

糙皮侧耳pal2调控低温光照环境刺激下菌丝生长的分子机制

以糙皮侧耳野生型菌株和pal2基因干扰菌株为材料，通过对比菌丝在28℃始终黑暗培养和28℃黑暗培养3 d后进行15℃12 h光照/12 h黑暗培养6 d的环境刺激这两种条件下苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）基因pal2转录水平、酶活性、底物L–苯丙氨酸和产物反式肉桂酸含量的变化，以及分析外源添加不同浓度底物和产物对菌丝表型的影响，初步解释了环境刺激下菌丝生长速度减慢的原因，发现苯丙氨酸解氨酶及其编码基因pal2均能响应环境刺激，但酶活性、产物和底物含量与基因表达量相比存在明显地响应滞后性；阐明环境刺激通过诱导pal2转录水平下调，总酶活性升高，使菌丝胞内L–苯丙氨酸减少，反式肉桂酸含量增加，从而负调控糙皮侧耳菌丝生长的分子通路。     

糙皮侧耳蓝光受体基因Pcry的克隆及分析

采用快速获得基因末端法(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)克隆出糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)蓝光受体基因Pcry的全长cDNA序列。该cDNA全长1725 bp,含有一个1572 bp的开放阅读框,共编码523个氨基酸。表达模式分析显示该基因在子实体期表达量最高,菌丝期最低。该基因在蓝光照射后的菌丝中表达量最强,在黑暗培养的菌丝中表达量最弱。蓝光刺激可以增加该基因转录量。生物信息学分析发现其编码的蛋白是一种光信号蛋白,目的蛋白分子量为57.44 kDa,等电点为4.90,且该蛋白具有信号转导、调控其它基因转录的功能。     

金针菇转核育种研究

从金针12（黄色）次级菌丝提取细胞核，分别与白色金针菇白雪和白色糙皮侧耳原生质体在高钙、高PH条件下融合。对再生菌丝的研究结果表明，无锁状联合的单核菌丝不形成子实体，但双核化后形成的具有锁状联合的双核菌丝则具有形成子实体的能力。试验结果显示，金针12与白雪组合后代均为黄色金针菇；而金针12与白色糙皮侧耳组合后代中，大多数菌株形成的子实体形态与白色糙皮侧耳类似，仅1%-2%菌株形成的子实体形态与白色金针菇类似。     

高温胁迫下糙皮侧耳胞内钙离子对热激蛋白基因表达的调控

以糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)菌株CCMSSC00389为材料,研究高温胁迫(40℃、120min)下钙离子的响应及其对热激蛋白的调控。在高温胁迫条件下,在培养基中添加胞内钙离子螯合剂、胞外钙离子螯合剂、钙调蛋白抑制剂、质膜钙通道抑制剂、三磷酸肌醇受体拮抗剂,利用钙离子特异性荧光探针检测菌丝体胞内钙离子含量,采用荧光定量PCR检测热激蛋白的基因表达量。结果表明,高温胁迫促进胞内钙离子浓度升高,增加Hsp60、Grp78、Hsp90、Hsp104等4种热激蛋白的基因表达量;培养基中添加钙离子螯合剂或抑制剂会降低胞内钙离子浓度,抑制这些热激蛋白的基因表达。研究结果表明高温胁迫会诱导糙皮侧耳胞内钙离子浓度升高,参与信号转导,从而调控热激蛋白的表达来缓解高温胁迫引起的伤害。     

热胁迫下糙皮侧耳实时荧光定量PCR内参基因的选择

在组成型表达基因和热胁迫转录组数据中选择12个基因作为热胁迫下糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)实时荧光定量PCR的候选基因。以40℃热处理0.5、1、3、6、12、24、48 h的糙皮侧耳菌丝体为材料,采用候选基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR,运用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件对结果进行分析,评估12个候选基因的稳定性。结果显示β-微管蛋白基因、β-肌动蛋白基因和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因可以作为糙皮侧耳热胁迫下理想的内参基因,而丝氨酸蛋白酶基因、磷酸化酶基因和细胞周期蛋白不适合作为糙皮侧耳热胁迫下的内参基因。     

糙皮侧耳HMG-box转录因子分析与候选基因克隆表达

在糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的全基因组中鉴定出14个高速泳动蛋白(high-mobility group box,HMG-box)的编码基因(PoHMG1～PoHMG14)，对其进行特征、结构与系统进化分析，发现所有的HMGbox转录因子蛋白的三级结构高度相似，相对分子质量为6893.79～60397.29，蛋白PoHMG6、PoHMG11、PoHMG12与PoHMG13之间的亲缘关系较近。基于糙皮侧耳在菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体时期的转录组数据，对筛选到的转录因子基因PoHMG11进行克隆分析并探究其功能及表达特性，发现该基因全长序列1 517 bp，编码489个氨基酸，含有一个HMG-box结构域。通过大肠杆菌原核表达载体体外诱导表达出相对分子质量为5.5×104的蛋白，该重组蛋白在1 mol·L^-1 IPTG、25℃诱导表达6 h时表达量最高。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析糙皮侧耳在菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体阶段PoHMG11基因的相对表达量，发现该基因在成熟糙皮侧耳子实体中的表达量比其他生长发育时期显著...     

灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子生物学特性的初步研究

以获得弱木栓质化灵芝菌株为目的，利用液体培养4d的灵芝菌丝体和液体培养3d的糙皮侧耳菌丝体为材料，在PEG-Ca^2 系统中诱导原生质体融合，获得初筛融合子19株(F1～F19)。其中，融合子F8的菌丝生长速度和生物量均接近糙皮侧耳，显微镜下，其菌丝体与灵芝和糙皮侧耳的均不相同，木栓质化程度大于糙皮侧耳，小于灵芝。     

糙皮侧耳蓝光受体基因Po.WC-1的克隆及分析

从糙皮侧耳中克隆了蓝光受体Po.WC-1全长c DNA序列(Gene Bank登录号KY348758),其长度为1956 bp,编码651个氨基酸,分子量约为72 k Da。生物信息学分析表明Po.WC-1属于真菌蓝光受体蛋白,氨基酸序列中含有真菌蓝光受体保守的PAS结构域和Zn F结构域。Po.WC-1基因在大肠杆菌中成功表达表明成功克隆得到其完整ORF,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)分析表明在300 lx蓝光或白光条件,短时间光照下Po.WC-1的表达量明显上调,随着光照时间的增加表达量逐渐趋于稳定。研究结果将进一步从分子水平解析糙皮侧耳蓝光信号转导通路以及为生长发育奠定一定基础,从而为实际生产中的光信号调控提供理论支撑。     

糙皮侧耳品种的主成分及聚类分析

为选育高产优良的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)菌株,分别选取16个菌株的10个数量性状进行主成分和聚类分析.结果表明,前4个主成分的累积贡献率达87.448％;利用SPSS13.0软件中未旋转因子得分值计算出主成分得分,以特征值的贡献率大小为分配系数,计算出不同品种糙皮侧耳菌株的综合得分和排名,并聚类为3个组群,第1组的主要特点为产量高、菌丝生长速度快、单个子实体形态好;第Ⅱ组产量较高、菌丝生长速度较快、单个子实体形态较好;第Ⅲ组产量低、菌丝生长速度较慢.因此第1组和第Ⅱ组综合表现较好,可作为品种选育的优良材料.     

辣木枝屑栽培糙皮侧耳初探

目的:利用辣木枝屑为主料栽培糙皮侧耳。方法:通过辣木与常规配方对比试验,研究辣木对糙皮侧耳菌丝生长速度、菌丝长势及生物转化率的影响,以此评价辣木枝屑为主料栽培糙皮侧耳的可行性。结果:糙皮侧耳在辣木枝屑为主料的各配方中均能正常生长和出菇,以配方④(辣木枝屑60%,棉子壳38%,石灰1%,石膏1%)和配方⑤(辣木枝屑50%,杂木屑23%,棉子壳25%,石灰1%,石膏1%)表现最佳,菌丝长势强,生长速度分别为8.0 mm/d和7.3 mm/d,生物转化率分别为96.03%和93.51%,且均优于对照组。结论:辣木枝屑可用于栽培糙皮侧耳。     

外源性cAMP对糙皮侧耳原基形成的影响

以糙皮侧耳新831为材料,分别在含有不同浓度cAMP的SA培养基上培养菌丝,观察菌丝的生长发育情况。结果:与对照组相比,低浓度cAMP(0.5~3mmol/L)对平菇菌丝生长有促进作用,随着添加浓度的升高,菌丝生长受到抑制;当添加浓度为cAMP 1mmol/L时,菌丝蛋白含量最低且糙皮侧耳原基形成所需时间明显少于对照组;试验表明外源性cAMP对糙皮侧耳原基形成存在一定的影响。研究结果为进一步解析原基形成过程中cAMP的作用机制奠定了一定的基础。     

外源海藻糖对高温胁迫下肺形侧耳氧化损伤的缓解效应

 高温胁迫影响食用菌的品质和产量,由高温引起的氧化胁迫是导致损伤的主要原因。以肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）热敏感菌株CCMSSC 00494和耐热菌株CCMSSC 00499为试验材料,研究了外源海藻糖对其菌丝体高温胁迫下氧化损伤的缓解效应。结果表明,高温（40 ℃）胁迫48 h,热敏感菌株中硫代巴比妥酸反应物（TBARS）含量（代表氧化损伤程度）高于耐热菌株。外源海藻糖处理可以显著降低高温胁迫下菌丝体内产生速率、H₂O₂含量、脂氧合酶（LOX）活性和TBARS含量水平,缓解高温胁迫所引发的氧化损伤。另外,外源海藻糖对超氧化物歧化酶（SOD）活性有保护和提高的作用,对过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性有抑制作用,对过氧化物酶（POD）活性影响不明显。外源海藻糖对热敏感菌株的保护效应高于耐热菌株。     

黑木耳高温胁迫条件优化研究

以黑木耳(Auricularia heimuer)菌株为试验材料,研究不同温度下黑木耳菌株菌丝生长速率,确定黑木耳培养最适温度;探究不同温度和时间高温胁迫后菌丝恢复生长情况,以确定黑木耳高温胁迫最适条件.结果发现,黑木耳最适培养温度为30℃,高温胁迫最适条件为44℃处理2 h;在此最适高温胁迫条件下研究黑木耳菌丝恢复生...     

采用灰色关联度法评价玉米秸秆栽培的糙皮侧耳菌株

采用灰色关联度法筛选适合玉米秸秆栽培的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)菌株,10个菌株每株各栽培100袋,以菌丝满袋时间、菌丝长势、菌丝生长速度、污染率、菌盖直径、单包产量和生物学效率为主要性状指标,进行关联分析。结果表明:玉米秸秆栽培的糙皮侧耳菌株与理想"参考菌株"的关联度大小排序为3302、抗病2号、3500、丰优2010、春秋抗王、2008-A、特抗650、灰美2号、高产8105、红平菇。3302和抗病2号与理想"参考菌株"的关联度最大,与理想"参考菌株"最接近。     

咪鲜胺对糙皮侧耳（平菇）污染菌绿色木霉的抑制作用

采用菌丝生长速率法测定咪鲜胺对绿色木霉（Trichoderma viride）和5个不同品种糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）（平菇）的菌丝生长抑制活性|采用滤纸片抑菌圈法测定了其对绿色木霉分生孢子萌发的影响。结果表明：咪鲜胺能够极显著地抑制绿色木霉菌丝生长和孢子萌发,EC50值分别为2.536 mg·L-1和5.482 mg·L-1。同时咪鲜胺对平菇的菌丝生长也有一定的抑制作用,在咪鲜胺有效浓度为8.333 mg·L-1以下时抑制作用不显著|生料栽培试验也获得了相似的结果。