翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

防御素基因克隆和表达载体构建

人防御素(HNP)是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对于细菌、真菌乃至某些被膜病毒有广谱杀伤作用,是免疫系统中的重要组分。实验根据已发表的HNP-1cDNA序列,设计并合成了一对引物。以HL-60细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pUC18载体上,经筛选获得阳性重组子pUC18-HNP-1(pDFS1)。测序分析证实,扩增片段即为HNP-1cDNA。pDFS1再经SmaI与SalI酶切、插入pGEX-6p-1质粒构建HNP-1表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子最终获得pGEX-6p-1-HNP-1(pDFS2)重组质粒。     

DDF2基因克隆及植物表达载体构建

采用CTAB法提取拟南芥叶片总DNA,根据已报道的DDF2基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到1条约550 bp的特异片段,把该片段连接到pGEM-T Easy Vector.上进行测序,结果表明:该基因编码区全长546 bp,为开放阅读框,共编码氨基酸181个,与报道序列完全一致.并构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-DDF2,采用冻融法将其转入根癌农杆菌,为后期该基因遗传转化花卉,改良花卉品质,并提高其抗逆性打下了一定的基础.     

耐碱Mn-SOD基因克隆与真核表达载体的构建

以高产耐碱Mn-SOD产生菌Bacillussp.110-2总DNA为模板,通过PCR扩增得到耐碱Mn-SOD基因,编码一个完整的开放阅读框,共202个氨基酸,含18个碱性氨基酸,包括12个赖氨酸和6个精氨酸。与地衣芽孢杆菌同源性为99%,与极端耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)同源性为78.7%。克隆片段酶切后,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,获得毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-SOD。     

大豆GmPR10基因克隆与植物表达载体的构建

为探明大豆中PR10蛋白质基因的抗大豆花叶病毒(SMV)作用机理,从抗SMV材料中克隆到GmPR10基因完整的cDNA序列,GmPR10基因的开放阅读框(ORF)全长477 bp,编码158个氨基酸。序列比对与进化树分析结果表明：GmPR10是大豆中一个新的PR10蛋白质基因,GmPR10基因在大豆的根、茎、叶中均能表达,接种大豆SMV后该基因在大豆叶片中被强烈诱导并高效表达,推测其可能使植物本身获得系统抗性以抵抗外来病原菌的侵袭。该研究构建了GmPR10基因的植物表达载体,为探究GmPR10基因在大豆抗病中的分子作用机理打下了基础。     

翅碱蓬耐盐机制研究进展

翅碱蓬是一种在我国北方广泛分布的真盐生先锋植物,是修复受污染、高盐土壤的重要植物物种,研究其耐盐机制具有重要的科学意义和生态价值。本文综述了翅碱蓬耐盐机制的研究现状,包括叶片肉质化、胞内离子区隔化、调节叶绿素含量、合成渗透调节物质、调节丙二醛含量以及提高抗氧化系统能力等,同时指出了目前尚处于空白或有待深入的领域。     

角碱蓬液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆及表达载体的构建

[目的]克隆角碱蓬液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(ScNHX1),并构建其表达载体。[方法]以用400 mmol/L NaCl处理的角碱蓬为材料,利用RT-PCR技术从中克隆ScNHX1,并通过酶切、连接方法将ScNHX1连接至pCAMBIA1302载体中。[结果]试验成功克隆得到ScNHX1,测序得出该基因片段大小为1 617 bp,并成功构建了含该目的基因的表达载体pCAMBIA-ScNHX1。[结论]该研究为耐盐转基因植株的培育奠定了基础。     

葡萄扇叶病毒外蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT－PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物（GFLV－H）基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段，并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector。序列分析结果表明，该基因含有1515个核苷酸，编码504个氨基酸，其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88％和95％。目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121，经三亲交配导入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中。     

盐地碱蓬食用价值的研究

以幼嫩盐地碱蓬为试验材料,通过对其进行7种营养成分测定,研究其食用价值,为盐地碱蓬的开发利用提供参考。结果表明,新鲜碱蓬中糖、蛋白质含量丰富,富含粗纤维、类胡萝卜素和氨基酸,并含有VC,同时亚硝酸盐含量为1.125μg/g,完全符合安全食用标准,是一种可食用野菜。     

盐地碱蓬研究现状

对盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)抗盐能力、高盐胁迫下的生理生化变化、与抗盐相关的抗氧酶化活性及体内色素的分布进行了综述,并指出了其巨大的潜力和广阔的应用开发前景。     

盐地碱蓬PsaH基因的克隆及生物信息学分析

【目的】PsaH基因是编码光合反应光系统I(PSI)复合蛋白H亚基的基因。为深入开展该基因的耐盐功能研究及其在盐生植物耐盐机制中的作用提供了基础,并为改良作物耐盐性分子育种提供候选基因。【方法】研究从盐地碱蓬(Suaeda salsa)盐胁迫文库中筛选出一个与耐盐相关的PsaH基因,经测序获得全长cDNA序列,命名为SsPsaH(GeneBank Accession Number:KC4048847),对该基因进行生物信息学分析进行结构功能预测。【结果】该基因全长770 bp,开放阅读框(ORF)为438 bp,编码145个氨基酸;该基因所编码的蛋白定位于叶绿体膜系统,无信号肽,含有一个跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,二级结构多为无规则卷曲。同时,该基因在不同物种间具有较强的保守性,含有4个高度保守的结构域,系统进化树分析表明,其与菠菜亲缘关系最近。RT-PCR分析表明,SsPsaH基因在根、茎、叶中均有表达,但在茎和叶中表达量高于根。【结论】SsPsaH基因是编码光合反应光系统I(PSI)复合蛋白H亚基的基因。本研究为以后深入开展该基因的耐盐功能研究及其在盐生植物耐盐机制中的作用提供了理论基础。     

野生蔬菜盐地碱蓬的营养成分分析及评价

［目的］为野生蔬菜盐地碱蓬的开发利用提供理论依据。［方法］通过对盐地碱蓬中主要营养成分、矿物质及微量元素、氨基酸和维生素含量的测定,并以普通栽培蔬菜为对照,分析评价了盐地碱蓬的营养价值。［结果］盐地碱蓬中主要营养成分含量分别为：水分72.70%、粗蛋白2.61%、粗脂肪2.23%、总糖17.81%、还原糖3.64%、膳食纤维11.65%、灰分4.65%。氨基酸含量864.5 mg/g,其中必需氨基酸达393.9 mg/g;氨基酸评分中,除亮氨酸和色氨酸外,其余氨基酸分均在90以上;微量元素硒达17.4 μg/g;维生素中抗坏血酸含量为822 μg/g。［结论］盐地碱蓬是一种符合现代营养学对健康食品要求的野生蔬菜,具开发利用价值。     

盐地碱蓬红色素提取条件的研究

[目的]为碱蓬红色素的进一步开发利用提供理论依据。[方法]以滨海盐地碱蓬为原料,采用浸提法提取红色素,通过单因素试验研究盐地碱蓬红色素的提取条件。[结果]碱蓬红色素为甜菜红素,易溶于水和含水有机溶剂,属于水溶性色素,碱性条件下不稳定,酸性条件下稳定,在538nm波长附近有特征吸收峰。碱蓬红色素的提取效率随提取时间的增加先提高后降低,提取20min时效果最好。碱蓬红色素的提取效率随提取温度的升高而增加,温度为50℃时,提取效果最好。随着提取溶剂pH值的升高,碱蓬红色素的提取效率先提高后降低,当pH值为5时,提取效果最好。[结论]盐地碱蓬红色素的最佳提取条件为:以pH值为5的水作提取溶剂,50℃下浸提20min。     

翅碱蓬内生细菌鉴定及耐盐促生作用研究

对盐生植物翅碱蓬的根、茎、叶组织进行分离,纯化,得到内生细菌79株,经形态学和理化特征鉴定并结合16S rDNA片段测序分析,表明这些内生细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、盐单胞菌属(Halomonas)和泛菌属(Pantoea).通过考察所分离到细菌对异缘植物小麦盐分胁迫下种子萌发率和幼苗生长的促进作用,筛选出2株能够显著提高小麦耐盐性的内生芽孢细菌SE48和SE4.150mM NaCl胁迫条件下,SE48和SE4处理小麦的干重分别增加43.6％和36.8％;甚至在300mM NaCl胁迫条件下,SE48仍能使小麦幼苗于重增加18.5％.这表明翅碱蓬的内生细菌可望用于宿主耐盐性的提高及盐碱地土壤的开发利用.     

碱蓬多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶,是碱蓬甜菜红素合成的第一关键酶.以盘锦红海滩碱蓬(盐地碱蓬)为研究材料,采用同源克隆法,根据植物中已克隆出的PPO序列进行引物设计,利用RT-PCR和RACE技术,从碱蓬中克隆出的PPO基因cDNA全长为1830bp,编码609个氨基酸.序列分析表明,与其他植物PPO核苷酸序列的相似性为69％～87％,氨基酸的相似性为49％～62％.碱蓬多酚氧化酶基因的成功克隆,为碱蓬甜菜红素的研究和利用打下了坚实的理论基础.     

EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达

[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。     

盐地碱蓬生理特性及栽培研究进展

盐地碱蓬是一种典型的盐碱地指示植物。综述了盐地碱蓬生理、品种选育和栽培方面的研究进展,以供相关研究参考。     

蝴蝶兰MADS-Box基因克隆及植物表达载体的构建

【目的】克隆蝴蝶兰MADS-Box基因并构建其正义和反义植物表达载体,为其功能研究奠定基础。【方法】以蝴蝶兰杂交品种(Phalaenopsis hybrid cv.Jiuhbao Red Rose)为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术从花葶中克隆MADS-Box基因,并构建正义和反义植物表达载体。【结果】克隆获得一个蝴蝶兰MADS-Box基因,命名为DtpsMADS1(GeneBank登录号JQ065097)。该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp的5'非编码区、185 bp的3'非编码区和一个738 bp的编码区;该基因编码245个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白质为碱性亲水性蛋白,具有62.45%的α-螺旋,8.16%的延伸链和29.39%的不规则折叠。序列比对和系统进化分析结果表明,DtpsMADS1与蝴蝶兰ORAP13的亲缘关系最近,同源性达99.0%,与石斛和蕙兰的同源性分别为83.0%和82.0%,属于MADS家族A类亚家族。将DtpsMADS1基因连接到植物表达载体pBI121上,构建获得正、反义植物表达载体pBI121-DtpsMADS1-S和pBI121-DtpsMADS1-A。【结论】成功克隆的蝴蝶兰DtpsMADS1基因属于MADS家族A类亚家族,具有明显的保守性和特异性,可为蝴蝶兰DtpsMADS1基因功能的鉴定及蝴蝶兰的遗传改良奠定基础。     

盐生植物盐地碱蓬染色体核型分析

以分布于内蒙古地区盐渍土的藜科盐生植物盐地碱蓬根尖为材料,采用常规压片法,对其染色体数及核型进行分析。结果表明:盐地碱蓬的染色体为二倍体,染色体数为2n=2x=16,基数为x=8。染色体中有正中部着丝粒染色体(M)、中部着丝粒染色体(m)、亚中部着丝粒染色体(sm)3种,盐地碱蓬属于"1B"型,且其核型不对称系数均小于60%,属于较为原始的物种。     

滩羊肝脏α-TTP基因克隆及原核表达载体的构建

为克隆滩羊肝脏α-生育酚转移蛋白(α-TTP)CDS区基因并构建其原核表达载体,通过Trizol法提取滩羊肝脏组织总RNA,将其反转录为cDNA后利用人工合成和PCR扩增相结合的方法得到α-TTP CDS区基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a,命名为pET28a-TTPA。结果表明:扩增了滩羊肝脏α-TTP CDS区基因,同已公布的绵羊α-TTP序列同源性达99.76%,并且将其成功克隆至原核表达载体pET28a。结果为后续α-TTP基因原核表达及其抗体的制备奠定了基础。