多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP的克隆及功能分析

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草（品种“顶峰”）中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构建LpAQP与GFP融合的瞬时表达载体,采用基因枪法转入洋葱表皮细胞,观察其细胞定位;通过real time-PCR分析LpAQP的表达模式,并用Southern杂交分析其拷贝数。【结果】克隆获得LpAQP的cDNA序列,GenBank登录号为JX569791,其开放阅读框（ORF）为867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质分子量为30.7 kD。该基因含有2个NPA单元,6个跨膜区,LpAQP含有与MIP家族完全一致的蛋白质保守区,其氨基酸序列与其它禾本科PIP类质膜型水通道蛋白同源性较高。物种间聚类分析表明LpAQP与大麦、小麦质膜型水通道蛋白同源性较高。LpAQP可能定位于细胞质膜上。通过Southern杂交分析,发现LpAQP在黑麦草基因组中以单拷贝存在。real time-PCR分析表明LpAQP在黑麦草茎部表达高于叶和根,持续干旱胁迫会导致LpAQP表达量先上调后下降。【结论】克隆获得黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP,其以单拷贝形式存在,在黑麦草根、茎、叶中均有表达,尤其是茎中表达最高。其表达受干旱胁迫影响。     

鹿茸顶端组织GHR基因的cDNA克隆及组织定位

【目的】检测鹿茸顶端组织GHR基因的表达,为鹿茸再生的分子机理研究提供理论依据。【方法】根据GenBank已发表的牛、山羊和绵羊生长激素受体(GHR)基因序列,用CLUSTAL W软件进行同源性分析,在保守序列设计克隆鹿GHR基因编码序列的引物。以3~4岁健康鹿生长30 d的鹿茸顶端组织提取的总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆GHR基因的cDNA序列;并用原位杂交技术对GHR基因在鹿茸顶端进行组织定位。【结果】成功克隆到了1 967 bp的序列(GenBank登陆号为EU381142),该序列包含GHR基因的全部编码序列。鹿GHR基因与牛、羊、人GHR核苷酸同源性分别为97%,97%和80%,GHR蛋白氨基酸序列同源性分别为97.9%,97.6%和77.3%。杂交结果显示,在皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层的阳性组均有蓝色杂交信号。【结论】利用RT-PCR技术和原位杂交技术在鹿茸顶端皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层均检测到GHR的表达。     

香草兰VpLFY基因的克隆与表达分析

花分生组织特征基因LEAFY在植物花芽分化与成花诱导途径中起着重要的调控作用。通过RACE方法从香草兰中克隆Vp LFY基因的全长c DNA序列。结果显示,该基因包含一个1 493 bp的开放阅读框,编码491个氨基酸残基。经蛋白质序列同源比对分析结果发现,Vp LFY属于FLO-LFY家族。组织特异性研究结果表明,Vp LFY基因在香草兰组织中属于组成型表达。荧光定量分析结果表明,Vp LFY基因分别在香草兰纯花芽和混合花芽的不同发育阶段中有着较强的表达。     

大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5的克隆与分析

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】 从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5（GenBank 登录号HQ123259）。Hg-pel-5 基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有20个氨基酸残基的信号肽和4段细菌结构的果胶酸裂解酶第三家族的保守位点。原位杂交确定Hg-pel-5在大豆孢囊线虫亚腹食道腺中表达。半定量RT-PCR结果表明Hg-pel-5在寄生前和寄生过程早期的2龄幼虫大量表达。Southern杂交结果显示Hg-pel-5存在于大豆孢囊线虫基因组中并以多拷贝形式存在。【结论】对大豆孢囊线虫中1个新的果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5进行克隆和分析,表明该基因在大豆孢囊线虫早期寄生过程中发挥重要作用。     

外源赤霉素对桃的成花效应及其作用机制

 【目的】揭示赤霉素对桃成花的影响及其可能的作用机制。【方法】在桃花诱导期叶面喷施100 mg?L-1 GA3,运用解剖学、免疫组织化学及半定量RT-PCR方法,研究‘八月脆’桃花芽分化过程中顶端分生组织赤霉素的原位分布及成花关键基因表达变化。【结果】‘八月脆’桃在7月10日前处于成花诱导期（北京）;成花诱导期叶面喷施100 mg?L-1GA3显著抑制了桃花诱导及进一步的正常分化,处理后成花率仅为11.67%;顶端分生组织中GA1的分布随花芽分化进程而变化,6月13日－7月25日,花芽中GA1主要分布在芽基部的维管组织中,顶端分生组织中没有检测到信号。GA3处理后,GA1的分布在6月13日－7月3日与正常花芽相同,在7月13日顶端分生组织中检测到了GA1信号,且芽基部维管组织中的GA1信号增强,但至7月25日顶端分生组织和芽基部维管组织中的GA1信号明显减弱;GA3处理后,芽中PpLEAFY 及MADS6基因仅在10月10日低量表达,其它时期几乎检测不到。【结论】在北京,‘八月脆’桃成花诱导期在7月10日之前;成花诱导期100 mg?L-1 GA3处理能显著抑制花诱导和进一步正常分化;赤霉素家族中GA1 类在桃成花过程中起抑制作用,并且具有一定的时期性;GA3处理抑制了成花关键基因PpLEAFY及MADS6的正常表达。     

中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1的分离和特性分析

【目的】NPR1是调控植物抗病反应的一个关键基因。对中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1进行分离和特性分析。【方法】利用RT-PCR和RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得TiNH1全长cDNA序列，利用Northern和Southern分别研究TiNH1表达特性及其在中间偃麦草基因组中存在形式。【结果】获得了该基因cDNA序列，命名为TiNH1。其编码蛋白TiNH1的氨基酸序列分别与水稻、烟草和拟南芥的NPR1同源性为80%、54%和46%。Northern杂交分析结果表明：TiNH1基因在正常情况下有微量表达，在小麦白粉病菌和纹枯病菌诱导下，该基因表达水平得到提高。Southern杂交分析结果表明；该基因以单拷贝形式存在于中间偃麦草基因组中。【结论】中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1编码由580个氨基酸组成的蛋白质TiNH，具有已知NPR1蛋白保守的结构域和功能氨基酸，可能参与寄主对小麦白粉病菌和纹枯病菌的防御反应。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状,分析其T-DNA插入位点的侧翼序列,克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因,为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础,并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测,分析其生物学性状;Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数;利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列;运用RACE-PCR技术,克隆与插入位点毗邻的基因全长;用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降,产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现,T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处,半定量PCR结果表明,Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。     

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长DNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR 和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号：HQ444960, CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI＝5.66,分子量MW＝53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop 环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。