笋瓜韧皮部蛋白基因启动子的克隆及其功能初探

笋瓜韧皮部蛋白ＰＰ２是一种特的结合几个丁质的凝集素,具有韧皮部组织特异性。为了研究该基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程中潜在的应用价值,根据发表的序列,用ＰＣＲ方法从笋 瓜基因组中扩增得到了ＰＰ２基因启动子片段。     

拟南芥花药特异启动子启动的Barnase基因在烟草中的表达

为探明植物基因工程雄性不育温度敏感性的影响因子，以拟南芥（Arabidopsis thaliana)WS生态型基因组DNA为模板，PCR扩增后分别得到0.78kb的A6和0.3kb的A9基因5'旁侧区DNA片段。将其分别与核糖核酸酶Barnase基因融合，导入含有抗溴苯腈（Bxn)基因的植物双元表达载体构建成pWPA6N和pWPA9N，并经根癌农杆菌（Agrobactrium turmefaciens)LBA4404介导获得转基因植株。生物学观察表明，转基因植株表明出了明显的转化不育性状，如花丝变短，花药瘦小等，说明A6，A9两5'启动子片段都在烟草（Nicotiana abacum)花药中定位启动了Barnase的表达，另经高温敏感性测试均可见育性恢复现象,这初步表明雄性不育植株的高温不稳定性由启动子造成的可能性较小。     

烟草花药特异启动子的克隆,活性测定及雄性不育基因和恢复基…

采用聚合酶链式反应方法（ＰＣＲ），以烟草叶片ＤＮＡ为模板扩增得到１．５ｋｂ花药特异启动子ＴＡ２９的基因片段。然后克隆到ｐＧＥＭ７２ｆ（＋）的ＳｍａＩ位点上。序列分析结果表明，该基因片段两端２８０ｂｐ区段的碱基序列与资料报道的完全相同。经转化离体组织测定，该启动子具有花药特异启动活性。该启动子经与核酸酶Ｂａｒｎａｓｅ及其相应的抑制剂Ｂａｒｓｔａｒ基因分别融合后构建成雄性不育基因和恢复基因。     

马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析

叶片是植物光合作用器官,在能量固定和利用中具有重要作用,研究光诱导型茎叶特异表达启动子的作用元件及其功能对于其调控基因的表达研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究用PCR技术从马铃薯(Solanum tuberosum L.)基因组中分离了光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的1556bp序列,序列分析表明,该片段与已报道的ST-LS1启动子(Gen Bank accession No.X04753.1)有99.68%的同源性,包括参与芽的特定表达和光反应顺式作用元件as-2-box、光效应顺式作用元件G-box等。将该片段与GUS基因融合,构建了植物表达载体pBⅠ121-ST-LS1,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得了转基因植株。用qRT-PCR和GUS活性组织染色检测转基因烟草植株,结果表明,在ST-LS1启动子驱动的GUS转基因烟草植株的叶和茎中能够检测到GUS基因的表达,根中则检测不到;对黑暗、恒温光照培养、自然光条件处理20d后的转基因植株分析表明,在黑暗处理的转基因植株中GUS基因无表达,而在自然光条件处理转基因植株的叶和茎中GUS基因的表达高于恒温光照培养的转基因植株。结果可为应用基因工程改良农作物品种提供理论和应用依据。     

植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析*

利用基因重组,将来自于拟南芥（Arabidopsis thaliana)的发生单个碱基突变的als基因插入含有AtNHXI1基因的质粒pCAMBIA1300中,由CaMV35S启动子分别启动AtNHX1和als的表达,得到了兼有除草剂抗性基因和耐盐相关基因的植物表达载体。用烟草叶盘转化法获得了转基因植株。Southern杂交检测表明,外源基因已经整合到烟草(Nicotiana tobacum)基因组中。抗性测定发现,转基因植株除草剂抗性至少提高了1000倍,而耐盐性提高了约1．0％NaCl浓度,即带有同样启动子的不同外源基因赋予转基因植株的抗性程度有明显差异。     

水稻醇溶蛋白4a基因启动子在转基因水稻中的特异性表达

利用ＰＣＲ方法从水稻“中花８号”基因组中扩增出醇溶蛋白４ａ基因启动子后,将其与ＧＵＳ基因融合,通过基因枪法导入水稻“台北３０９”中。对转基因水稻植株进行的组织化学分析表明,ＧＵＳ基因特异性在种子的胚乳中表达,而在其它的组织中没有表达。水稻醇溶蛋白基因４ａ启动子的胚乳特异性表达可以稳定遗传到下一代。     

表达dsRNA的转基因烟草能阻止烟草花叶病毒的侵染*

将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的部分运动蛋白基因(AMP)构建成反向重复结构，插入植物表达载体pBin438上，通过三亲交配法导人根癌农杆菌(Agrobactetqum tumefaciens)菌株EHl05后通过农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacam)品种云烟87，获得了50株转基因烟草。PCR和Southern blot分析表明目标基因已整合到烟草植株的基因组内。用TMV对转基因烟草进行挑战接种，症状观察和病毒浓度的TAS-ELISA检测表明，转基因烟草对TMV的抗性包括3种类型：免疫型占10％；抗病型占4％；感病型占86％。Northern blot分析表明，目标基因mRNA在不同抗病类型植株中的积累量存在明显差异，目标基因mRNA的积累量与抗病性成负相关。     

germin基因的克隆及其在烟草中的表达

摘要：克隆了具有草酸氧化酶活性的小麦(Triticum aestivum )Germin蛋白的基因，构建了植物表达载体并用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )介导法转化烟草。Southern杂交和酶活性检测表明，germin基因在转基因烟草(Nicotiana tabacum )中得到整合、表达，并正确组合成具有草酸氧化酶活性的同源六聚体蛋白。离体实验表明，外源germin基因的表达提高了转基因烟草离体叶片对草酸的耐受性。     

拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达

利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。     

大熊猫生长激素基因AmGH的植物表达载体构建及其在烟草中的表达

以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)生长激素基因AmGH构建到植物表达载体pCAMBIA13011-GH上,用根癌农杆菌(Agrobacterium turaefacicas)GV3101介导转化烟草(Nicotiana tabacum)无菌叶片外植体,经过两轮潮霉素(hygromycin,Hyg)筛选,从50株再生植株中筛选到12株抗性植株,经GUS组织化学检测和PCR鉴定,其中4株为阳性,表明AmGH基因已成功地转化并整合到烟草基因组中,RT-PCR检测表明,大熊猫生长激素基因AmGH已在转基因烟草中表达.这是首次报道大熊猫生长激素基因在植物系统中表达.     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF（LEAFY同源基因）和PTAG（AGAMOUS同源基因）是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将35S：：PTLF-PTAG-IR导入烟草（Nicotiana tabacum）。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL（LEAFY同源基因）和NAG1（AGAMOUS同源基因）的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明：与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S：：PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。     

RNA沉默介导的转基因烟草抗中国番茄黄化曲叶病毒研究

近年来,中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)病在我国自南向北不断蔓延,发病地块减产甚至绝产,造成了巨大的经济损失.本研究应用RNA沉默(RNA silencing)防治病毒病原理构建TYLCCNV外壳蛋白(coat protein,CP)部分基因片段dsRNA(double-strand RNA)导入本氏烟(Nicotiana benthamiana)获得了抗TYLCCNV的转基因烟草.实验结果表明,目的基因已整合到转基因烟草植株的基因组中.用TYLCCNV侵染性克隆接种转基因烟草,症状观察和PCR检测发现,对TYLCCNV表现为免疫的转基因烟草占14.6％.Northern blot分析表明,在不同的抗病类型转基因植株中,目的基因mRNA的积累量存在明显的差异,其积累量与抗病型呈负相关.研究结果对利用RNA沉默防治TYLCCNV有一定的理论指导意义.     

无抗性标记基因转基因植物研究进展

植物转基因研究中抗生素和除草剂抗性标记基因可以提高转化体的筛选效率。然而，对抗性标记基因潜在的生物安全性疑虑阻碍了植物转基因研究的发展和应用。解决抗性标记基因安全性问题的策略有标记回避和标记剔除两类，前者是在转化阶段不使用抗性标记基因或采用安全标记基因筛选转基因植株；后者则采用抗性标记基因筛选获得转化体后剔除标记基因。无抗性标记基因转基因植物不仅促进转基因技术的发展，而且缓解潜在的生物安全问题。     

反向重复RNA介导转基因烟草对花生条纹病毒抗性

构建携带花生条纹病毒（Peanut stripe virus, PStV）外壳蛋白基因（cp）反向重复序列植物表达载体pKcp，转化农杆菌菌株GV3101，叶盘法转化本生烟，卡那霉素筛选得到的转化植株5~6叶期摩擦接种PStV。通过症状观察和ELISA检测，T0代转基因烟草植株87%表现免疫，T1代不同系植株的免疫比例为60~100%，T2代多数系植株免疫比例达到100%。利用PStVcp特异探针对转基因植株T1代进行特异siRNA的Northern blot检测，转基因植株都含有不同量的特异siRNA，而非转基因植株不含特异siRNA；接种前，免疫植株比感病植株体内siRNA含量高；不同转化系免疫植株在接种前、接种15天和50天后的叶片中都检测到特异siRNA，同一植株不同时期，siRNA含量相对稳定；不同转化系植株体内siRNA含量存在差异。本试验成功利用dsRNA获得对PStV具有较高比例抗性的转基因烟草植株。     

转基因植物疫苗的研究进展

随着基因工程技术、免疫学和分子生物学技术的飞速发展,疫苗的种类不断增多、生产方式不断建立和优化。利用转基因技术将植物作为生物反应器,生产出转基因植物疫苗已成为研究热点之一。转基因植物疫苗的制备主要通过目标抗原的确定、受体植物的选择、植物表达载体的构建、转化、表达及检测等步骤组成。目前,转基因植物疫苗按照功能可大体分为细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗、避孕疫苗及糖尿病疫苗等,并已成功在植物中陆续表达了抗原基因。经一系列生物或临床试验后,在机体中均产生了明显的免疫应答,在试验范围内分别起到了抵抗病原微生物、防治寄生虫、避孕、预防治疗糖尿病等作用。通过优化启动子、选取高表达量受体植物、采用外源蛋白叶绿体表达、敲除转基因植物抗性基因等手段,将不断弥补转基因植物疫苗应用方面的不足。本文主要综述了转基因植物疫苗创制的基本流程、研究进展等,以期为今后转基因植物疫苗的开发和应用提供参考与思路。     

转基因植物的安全性评价

本文论述了转基因植物安全性评价的意义。简要介绍了转基因植物安全评价的主要内容，环境安全性和食品安全性。同时，还介绍了一些国际组织、部分发达国家及我国在转基因生物安全性评价方面的一些相关法律法规。最后，对我国转基因植物的安全性评价和管理提出了一些初浅的建议。     

内蒙古中西部3种乡土植物根系抗拉力学特性的对比研究

[目的]研究内蒙古中西部地区3种乡土植物种根系的抗拉机理,为该区水土保持的树种选择提供依据。[方法]以内蒙古中西部地区3种常见植物柠条、沙棘和紫花苜蓿根系为对象,进行室内单根瞬时极限拉伸试验研究。[结果](1)3种植物单根极限抗拉力随着直径的增加而增大,单根极限抗拉强度随直径的增加均呈幂函数递减。(2)当直径在0.19mm~2.89mm范围内相同径级时,3种植物单根极限抗拉强度和弹性模量均值大小顺序相同,依次为:柠条沙棘紫花苜蓿,3种植物根径≤0.5mm的细根具有较大的极限抗拉强度和弹性模量;(3)同一树种当根系直径相同时,土壤含水率高则其单根平均极限抗拉强度小。[结论]根系的力学特性与形态结构特征的结合,是选择适宜的水土保持树种非常重要的因素。从根系抗拉性能方面评价3种植物根系固土抗蚀能力大小则柠条优于沙棘和紫花苜蓿。     

转基因植物中CaMV35S和tNOS元件的4种定性PCR检测方法的比较

花椰菜花叶病毒35S启动子(promoter of Cauliflower mosaicvirus 35S,CaMV35S)和胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,tNOS)是转基因产品筛选检测中的首选参数,日常检测中发现,个别标准中用于筛选检测这两种元件的引物存在非特异性扩增和灵敏度差的问题。本研究收集了国内外标准中常用的扩增片段分别为195、165、147和123 bp的CaMV35S和扩增片段分别为180、172、165和118 bp的tNOS各4对引物,应用普通PCR和实时荧光(Real-time)PCR方法,对8对引物的特异性、灵敏度及在加工品中的扩增性进行了测试和适用性评价。结果表明,CaMV35S 165和147 bp引物具有很好的特异性,灵敏度高,在不同的加工品中也表现出强的检测能力,筛选检测效果最佳;195bp引物扩增性稍差,且经常出现非特异性扩增;123bp引物较其他引物扩增弱且扩增不稳定。tNOS 172和165bp引物具有很好的特异性,灵敏度高,在不同的加工品中也表现出强的检测能力,筛选检测效果最佳;180bp引物扩增性较差,且易出现非特异扩增;118bp引物较其他引物扩增弱且扩增不稳定。本研究通过普通PCR和实时荧光(Real-time)PCR对不同国标中出现的引物进行适用性评价,为转基因产品的检测监管提供可靠技术依据。     

提高外源基因在转基因植物中表达效率的途径

利用转基因技术获得具有目的性状的转基因植株,是进行作物品种改良的有效方式.但基因沉默等现象降低了外源基因在转基因植物中的表达效率.从外源基因的DNA修饰水平、翻译后蛋白的定位、以及转基因方式等方面综述了国内外植物基因工程中的相关研究;分析了外源基因表达效率低的原因;提出了克服基因沉默并实现外源基因高效表达的途径.