微孢子虫系统发育研究进展

微孢子虫是一类专营寄生生活、具极丝但无线粒体的单细胞真核生物,介绍了生物学特征、核糖体的SSU rRNA、ITS间隔序列、LSU rRNA、微管蛋白基因及蛋白质组学在微孢子虫的系统发育研究中的应用。     

2株微孢子虫热激蛋白Hsp70的ORF研究

为探讨微孢子虫的起源、分类地位及亲缘关系,在系统发育分析的基础上,对家蚕微孢子虫(Nosema.bombycis)和柞蚕微孢子虫(N.antheraeae) Hsp70基因的ORF序列进行克隆、测序,同时将2种微孢子虫的Hsp70基因的ORF序列翻译成氨基酸序列,利用Expasy蛋白质数据库的分析工具和DNAstar软件对其功能进行理论分析和预测.结果表明:家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的Hsp70氨基酸序列在N端均有一个高度保守的基序GIDLGTT,另外还有被作为线粒体Hsp70标志的2个保守的基序;氨基酸序列相似性比较结果发现,家蚕微孢子虫广东株Hsp70的蛋白氨基酸序列和家蚕微孢子虫日本株的相似性最近,约为96％.系统发育分析发现,微粒子属和变形虫属有较近的亲缘关系.功能预测表明,2种微孢子虫在信号肽剪切位点、跨膜结构域及糖基化位点、二级结构、亲水性、柔韧性等方面均存在异同.     

蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段序列的测定及其系统发育分析

【目的】克隆蓝叶虫微孢子虫RPB1（RNA聚合酶II大亚基）基因片段,对其基因及编码的蛋白序列特征进行生物信息学分析,进一步明确蓝叶虫微孢子虫的分类学地位,为深入探究RPB1基因编码蛋白的具体生物学功能奠定基础。【方法】根据家蚕微孢子虫RPB1基因序列,采用Primer Premier 5.0软件设计6对同源引物,利用PCR技术克隆蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段;通过 GSDS、SMART、DNAstar、MEGA4.1等生物信息学分析软件对蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段进行系统发育分析。【结果】克隆得到了蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段序列,在GenBank登录号为KJ728831。该基因片段的长度为2 933 bp,包含一个长为2 922 bp的开放读码框,预测编码的蛋白质由974个氨基酸组成,蛋白分子量为109.38 kD,等电点为7.087。蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段结构为单外显子结构,编码的蛋白含有4个结构域：RPOLA_N、RNA_pol_Rpb1_4、RNA_pol_Rpb1_5和RNA_pol_Rpb1_6。其中,RPOLA_N结构域在原核和真核生物中都是非常重要的结构域。该蛋白质的二级结构主要由4种形式组成：α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角。α-螺旋和无规则卷曲所占比例相当高,延伸链主要位于α-螺旋和无规则卷曲之间。N-末端以α-螺旋的形式存在。多序列比对与系统进化分析发现,蓝叶虫微孢子虫和Nosema bombycis、N. trichoplusiae、Nosema sp. CPP、N. fumiferanae、N. disstriae、N. tyriae、N. granulosis 7种Nosema属微孢子虫聚类在同一进化支。蓝叶虫微孢子虫RPB1基因编码的蛋白与同一进化支上的其他7种微孢子虫RPB1基因编码的蛋白相似度在81.9%-99.6%,分化度在0.004-0.049。蓝叶虫微孢子虫与N. bombycis的RPB1基因序列相似性高达99.6%,并与N. bombycis具有非常近的亲缘关系。【结论】成功克隆了蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段,对其系统进化分析进一步证实了蓝叶虫微孢子虫确实属于Nosema属。     

绵羊肺炎支原体热休克蛋白Hsp70 C末端基因原核表达

为研究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)热休克蛋白Hsp70抗原特性,以Mo贵州分离株为模板扩增得到Hsp70蛋白C末端基因,将目的基因连接至pET-28a原核表达载体,经PCR、双酶切和序列测定正确的阳性重组质粒转化E.coli Rosseta表达菌,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,经PCR从Mo贵州分离株扩增获得567bp的C末端片段,并成功构建含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达获得分子质量约为27ku的目的蛋白,且目的蛋白能与Mo阳性血清印迹反应。说明,成功构建可有效表达Mo贵州分离株Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体。     

莲草直胸跳甲Hsp70蛋白的生物信息学分析

根据莲草直胸跳甲Hsp70基因的EST序列,利用电子克隆的方法获得莲草直胸跳甲Hsp70基因,通过生物信息学方法对该基因编码蛋白进行了保守结构域、疏水/亲水性、亚细胞定位、信号肽等理化性质和分子特性分析。结果表明,莲草直胸跳甲Hsp70基因全长2 216 bp,完整读码框1 899 bp,编码632个氨基酸残基,分子量为69.45 k Da,等电点为6.00;编码蛋白含有Hsp70的完整保守结构域和典型签名序列;具有的典型细胞质基序和亚细胞定位分别表明Hsp70位于细胞质中。研究结果可为深入研究该基因的生物学功能奠定基础。     

昆虫热休克蛋白Hsp70的研究进展

热休克蛋白Hsp70诱导性显著,合成量多并具有高度的保守性。Hsp70表达于所有的活体细胞中。Hsp70具有分子伴侣、抗细胞凋亡功能,参与免疫反应、抗氧化功能,可以提高细胞对环境胁迫或伤害的耐受性。文章对Hsp70的特性以及其在昆虫学中的研究意义、研究现状及前景进行了综述。     

一株从原蚕分离的微孢子虫的生物学特性及其系统发育分析

[目的]研究从广西蚕种繁育中分离获得的微孢子虫,调查其感染性和分类地位,为蚕种生产掌握病原来源及有效控制家蚕微粒子病流行提供参考依据.[方法]采用生物试验测定从蚕种生产一线分离获得微孢子虫(GXM14)对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率,显微镜观察其孢子形态,采用吉姆萨染色法观察孢子的生活史;通过PCR扩增及测序获得GXM14的SSU rRNA基因序列和ITS序列,并利用MEGA 5.0和DNASTAR中的Megalign构建系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析.[结果]GXM14孢子呈卵圆形,大小为(1.68±0.15)μm×(3.06±0.15)μm,其孢子生活史中有双核,以二分裂方式进行增殖,符合Nosema属的特征.GXM14对家蚕的IC50为3.53×105个/mL,是家蚕微孢子虫(N.b)的5.8倍;对家蚕的胚种传染率为5.0%,只是N.b的1/9.GXM14的SSU rRNA基因序列长度1226 bp,G+C含量为34.42%;ITS序列长度503 bp,G+C含量为29.82%.GXM14的SSU rRNA基因序列与甜菜夜蛾微孢子虫(Nosema sp.SE)SSU rRNA基因序列(KT336240.1)的遗传距离为0.2,相似度达98.9%,即GXM14与甜菜夜蛾微孢子虫(KT336240.1)的亲缘关系很近.基于微孢子虫ITS序列的相似性和遗传距离分析结果表明,GXM14与12株已知No-sema属微孢子虫的相似度均低于91.0%,而遗传距离在4.0以上,证实GXM14是一种新的微孢子虫,故将其暂命名为Nosema sp.GXM14.[结论]从蚕种生产一线分离获得的家蚕病原性微孢子虫(GXM14)属于Nosema属,与N.b同属异种,是一株新的微孢子虫,可能是野外昆虫微孢子虫交叉感染家蚕的病原.因此,在蚕种繁育中加强防虫杀虫,防止昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕,是控制家蚕微粒子病暴发流行的重要措施.     

微孢子虫起源和进化研究进展

微孢子虫是一种典型的机会性致病病原,具有特殊的真核生物构造。综述了微孢子虫起源和进化的研究进展,以及在分析其系统发育过程中的一些潜在的问题及解决的方法,并提出β-微管蛋白及多基因研究在分析微孢子虫进化中具有重要性。     

家蚕微孢子虫抗体免疫荧光检测方法的建立及应用

通过制备家蚕微孢子虫总蛋白多克隆抗体,建立了多克隆抗体免疲荧光检测方法（IFA）,并利用此方法特异性地检测出了体外培养细胞系（家蚤胚胎细胞系BmE—SWUI）中处于不同发育阶段的家蚤微孢子虫。结果在细胞爬片中可观察到呈较强的黄绿色荧光微孢子虫以及在BmE—SWU1细胞中的寄生分布情况,还可看到孢子极丝的弹出等现象。IFA检测方法鉴别诊断家蚕微粒子虫具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便等特点,可以广泛应用于微孢子虫形态学、流行病学以及蛋白质的定位等研究领域。     

家蚕微孢子虫抗体免疫荧光检测方法的建立及应用

通过制备家蚕微孢子虫总蛋白多克隆抗体,建立了多克隆抗体免疫荧光检测方法(IFA),并利用此方法特异性地检测出了体外培养细胞系(家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1)中处于不同发育阶段的家蚕微孢子虫.结果在细胞爬片中可观察到呈较强的黄绿色荧光微孢子虫以及在BmE-SWU1细胞中的寄生分布情况,还可看到孢子极丝的弹出等现象.IFA检测方法鉴别诊断家蚕微粒子虫具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便等特点,可以广泛应用于微孢子虫形态学、流行病学以及蛋白质的定位等研究领域.     

间接免疫荧光方法检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达

采用间接免疫荧光方法对小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达进行检测.结果表明,小鼠睾丸组织Hsp70呈极强的表达(+++),并且在各级生精细胞及支持细胞都呈极强表达;小鼠附睾头、附睾体、附睾尾的Hsp70呈现极强表达(+++),主要在附睾上皮细胞,而管腔内精子偶见阳性染色.说明间接免疫荧光方法能够特异性、原位地检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达,而且操作简单,适用于研究Hsp70在精子发生和成熟过程的作用.     

热激蛋白70在环境中的作用与应用

热激蛋白在各类生物体内普遍存在。热激蛋白70在生物体受到环境胁迫,如热胁迫、有机污染胁迫、重金属污染胁迫等时会大量表达,是反映环境污染程度的有效生物学标志物,在环境监测与环境保护方面具有重要的作用。系统地综述了其在环境中的作用与应用。     

CaM对小鼠胎儿成纤维细胞Hsp70表达的影响

[目的]证实小鼠胎儿成纤维细胞中钙调蛋白 (calmodulin,CaM) 基因参与热应激诱导型热休克蛋白70(Hsp70)的基因表达并明确其作用条件.[方法]取12.5 d孕鼠胚胎制备成纤维细胞(MEF),上述细胞随机分为对照组和热应激组:对照组在37℃条件下培养,热应激组包括I组(39℃、0.5 h),Ⅱ组(39℃,1 h),Ⅲ组(39℃,1.5 h),Ⅳ组(41℃、0.5 h),V组(41℃、1 h),Ⅵ组(41℃、1.5 h);每组3个重复.将选择的热应激组和对照组细胞分别加入不同浓度(25、50及100 mm=ol·L<'-1>)钙调蛋白拮抗剂W7,运用RT-PCR检测Hsp70、CaM mRNA表达量.[结果] 39℃和41℃热应激组Hsp70 mRNA表达量显著高于常温对照组(P<0.05):39℃应激1h的Hsp70 mRNA表达量极显著高于其它各组(P<0.01);39"C应激0.5 h和1 h CaM mRNA表达量极显著高于其它各组(P<0.01);41℃热应激组的CaM mRNA表达量与常温对照组比较差异不显著(P>0.05).在培养液中加100 mmol·L<'-1> W7、分别于37℃和39℃处理1 h后,其成纤维细胞的Hsp70 mRNA表达量极显著低于相应对照组 (P<0.01).[结论]中度热应激条件下,Hsp70和CaM基因表达量呈正相关,且39℃应激1 h可以显著诱导Hsp70和CaM基因表达;CaM通过某种途径参与了Hsp70基因表达.     

基于Hsp70基因的马梨形虫分类学定位分析

 【目的】为了进一步确定马泰勒虫的分类学定位。【方法】根据GenBank上登录的马巴贝斯虫Hsp70基因序列（AB248743.1）,设计引物TeHsp70F, TeHsp70R,以马泰勒虫基因组DNA为模板进行扩增,获得全长为1 920 bp的核酸片段。将该基因序列与GenBank中23种已知虫种的相应序列进行分析比较。【结果】该片段编码639个氨基酸,其疏水性氨基酸达到208个,极性氨基酸167个。同一性分析显示,该基因片段与报道的马巴贝斯虫Hsp70基因（B. equi  BAF02625.1）亲缘关系最近,其次是小泰勒虫(T. parva  XP764717.1)和环形泰勒虫(T. annulata AAA30130.1),而与感染马属动物的另一个虫种驽巴贝斯虫(B. caballi BAF02619.1)亲缘关系较远。【结论】马泰勒虫Hsp70基因的克隆及系统发育分析显示,之前被定名为马巴贝斯虫（B. equi）的虫种隶属于泰勒虫虫种。本试验为马巴贝斯虫正确更名为马泰勒虫（T. equi）的分类地位提供了又一佐证。     

携Hsp70的PRRSV ORF5与ORF6基因重组质粒构建及在Cos-7细胞中的表达

为构建高效猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)DNA疫苗,利用Hsp70作为免疫佐剂增强免疫功能的特点,构建了含PRRSV ORF5,ORF6基因的融合表达载体pCI-ORF5-ORF6A,以及携带HSP70基因的融合表达载体pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70,转染Cos-7细胞。IFA检测结果显示,两个融合表达载体均能在Cos-7细胞中表达;Western blot检测证实转染质粒pCI-ORF5-ORF6A和 pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70在42.7 Ku,112.2 Ku分别表达出特异性条带。结果显示所构建的重组质粒能在Cos-7细胞内进行良好的表达,且表达的蛋白具有免疫原性。     

热应激对小鼠睾丸Hsp70-2基因mRNA转录水平的影响

用半定量RT-PCR方法检测不同温度、相同时间(4 h)热应激处理小鼠睾丸组织中Hsp70-2基因的mRNA转录水平,以研究热应激对Hsp70-2基因mRNA转录的影响。结果显示,各热应激组小鼠睾丸Hsp70-2 mRNA转录水平下降,并且温度越高,其下降幅度越大。与对照组相比,33℃组小鼠Hsp70-2 mRNA相对转录水平显著(P<0.05)下降,而37℃组和42℃组下降极显著(P<0.01)。42℃组Hsp70-2 mRNA相对转录水平仅为对照组的44.7%。上述结果说明,热应激使Hsp70-2基因mRNA转录水平下降,热应激对雄性生殖机能的影响与Hsp70-2减少有关,而Hsp70-2 mRNA转录水平可以作为热应激对雄性生殖机能损伤程度的判断指标之一。     

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因与抽薹特性的表达分析

[目的]探讨叶用莴苣热激蛋白Ls Hsp70-3701和Ls Hsp70-1707基因在抽薹前后的表达水平,分析Hsp70基因与叶用莴苣抽薹的相关性。[方法]采用实时荧光定量方法检测Ls Hsp70-3701和Ls Hsp70-1707基因在不同品种中的相对表达量,分析其差异性。[结果]Ls Hsp70-3701基因在热敏品种P-S11抽薹期的表达量显著高于抽薹前;在耐热品种G-S59抽薹初期的表达量与抽薹前无显著差异,但后期表达量显著降低。Ls Hsp70-1707基因在热敏品种P-S11抽薹初期表达量与抽薹前差异不显著,但其后表达水平显著高于抽薹前;在GS59中抽薹期的最大表达量低于抽薹前的最大表达量,但两者差异不显著,而其他时间的相对表达量却显著低于抽薹前最高水平。[结论]Ls Hsp70-3701和Ls Hsp70-1707基因与叶用莴苣抽薹具有一定的相关性,叶用莴苣抽薹是差异基因表达的结果。     

热应激对小鼠睾丸组织Hsp70表达的影响

利用化学恒温培养箱对小鼠实施42℃1 h/d的热应激处理,建立持续的全身热应激动物模型。在热应激持续到8、13、21和35 d时,颈椎脱臼处死小鼠,应用免疫荧光组织化学和蛋白质印迹分析的方法检测睾丸组织Hsp70的表达。结果显示,对照组的小鼠睾丸组织Hsp70呈极强表达;热应激组小鼠睾丸组织Hsp70表达减弱,但随着热应激持续时间的延长,Hsp70表达逐渐恢复。热应激处理8 d后的小鼠睾丸组织Hsp70呈弱表达、13和21 d后呈极弱表达、35 d后呈弱表达。结果表明,Hsp70在小鼠睾丸正常的精子发生过程中发挥重要的作用;持续性的热应激可以使机体建立热适应,Hsp70可作为睾丸组织对热应激产生热适应的生物学标志之一。