农杆菌介导的曼地亚红豆杉细胞遗传转化体系的建立

建立了根癌农杆菌介导的红豆杉细胞遗传转化体系,为红豆杉细胞的遗传改良打下基础。最优转化条件是:菌液光密度A600=0.6,侵染时间25 min,共培养最适温度21℃,共培养时间48 h;最适头孢霉素(Cephamycin,Cef)抑菌浓度为300 mg/L;最优的除菌及筛选方式为:用含100 mg/L头孢霉素的无菌水冲洗共培养后的细胞10 s,然后将细胞转至含300 mg/L头孢霉素的抑菌培养基上,两周后转至含150 mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)或8 mg/L潮霉素(Hygromycin,Hyg)的筛选培养基上筛选。采用小愈伤团法筛选转基因纯系,GUS染色显示,筛选后转化细胞株的阳性细胞占80%以上。     

杂交枫香胚性愈伤组织遗传转化体系研究

  目的  杂交枫香是我国重要的用材和观赏树种资源,但其遗传转化体系尚未建立。建立杂交枫香遗传转化体系为杂交枫香性状改良和基因功能研究提供了方法。  方法  本研究基于杂交枫香高效的体细胞胚胎发生技术,用根癌农杆菌介导的遗传转化法对其胚性愈伤组织进行遗传转化,对潮霉素选择压、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、以及共培养温度等影响因素采用正交试验等设计进行了研究。  结果  潮霉素对胚性愈伤组织的最小致死质量浓度为10 mg/L;获得最多Gus阳性斑点数的组合的菌液OD₆₀₀为0.8,共培养时间为3 d,侵染时间为10 min,共培养温度为25 ℃;获得最多转基因阳性愈伤组织的组合的菌液OD₆₀₀为0.2,共培养时间为2 d,侵染时间为10 min,共培养温度为23 ℃;且通过极差分析,最优处理组合的共培养时间为2 d,菌液OD₆₀₀为0.2,侵染时间为20 min,共培养温度为23 ℃。  结论  经分子鉴定,共获得210个转基因阳性愈伤组织,初步建立了农杆菌介导的杂交枫香遗传转化体系,为阔叶树种愈伤组织的遗传转化提供了更多的可行性依据。      

矮牵牛‘梅林’遗传转化体系的建立

在矮牵牛‘梅林’再生体系基础上,建立根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系,以获得转PSARK-IPT基因的矮牵牛植株。结果表明,转化效率最高的预培养时间为2d,农杆菌侵染浓度为OD600=0.5,侵染时间为3min;共培养时间为36h;适宜的抑菌抗生素头孢霉素浓度为500mg·L~(-1);潮霉素作为遗传转化中的筛选标记,选择2mg·L~(-1)为叶片分化筛选压,4mg·L~(-1)的Hey为最佳生根筛选压。对获得的15株潮霉素抗性植株进行PCR及RT-PCR检测,证明7株为阳性,证实目的基因已整合到这7株矮牵牛基因组中。     

农杆菌介导的甜椒遗传转化体系的建立

以低温渗透系甜椒CL122为材料,采用其子叶节为外植体材料,研究了农杆菌介导的甜椒遗传转化体系的主要影响因子,如卡那霉素选择压、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、侵染时间、共培养时间、激素浓度等,初步建立了一个高效的甜椒遗传转化体系。结果表明:最适的卡那霉素选择压为50 mg/L,乙酰丁香酮浓度在100μmol/L时可以明显提高外植体的抗性芽数,最适合的预培养时间和共培养时间为2 d,最佳侵染时间5 min,外植体在MS+0.2 mg/L IAA(吲哚乙酸)+400 mg/L特美汀培养基上生根率最高。     

农杆菌介导的甜椒遗传转化体系的建立

以低温渗透系甜椒CL122为材料,采用其子叶节为外植体材料,研究了农杆菌介导的甜椒遗传转化体系的主要影响因子,如卡那霉素选择压、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、侵染时间、共培养时间、激素浓度等,初步建立了一个高效的甜椒遗传转化体系。结果表明:最适的卡那霉素选择压为50 mg/L,乙酰丁香酮浓度在100μmol/L时可以明显提高外植体的抗性芽数,最适合的预培养时间和共培养时间为2 d,最佳侵染时间5 min,外植体在MS+0.2 mg/L IAA(吲哚乙酸)+400 mg/L特美汀培养基上生根率最高。     

剑麻遗传转化体系的建立与优化

以剑麻无菌苗叶片为试材,研究了潮霉素（Hyg）、菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（As）及羧苄青霉素（Car）等因素对剑麻遗传转化的影响。结果表明,剑麻最适遗传转化体系为：Hyg选择浓度为25 mg/L,OD600=0.6左右的农杆菌菌液,侵染时间为10～15 min,As浓度为200μmol/L,Car浓度为400 mg/L。     

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的建立

以玉米(Zea mays L.)HiII的幼胚为外植体,β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)为报告基因,通过农杆菌介导转化法对影响遗传转化体系的外植体大小、农杆菌浓度、热预处理温度、侵染时间、共培养及恢复培养时间、抗生素、筛选剂等因素进行优化,以建立农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系。结果表明,幼胚大小为1.0~1.5 mm,农杆菌菌液的OD600 nm为0.5,40℃热处理3 min,侵染8 min,共培养3 d和恢复培养4 d,100 mg/L羧苄青霉素作为抑菌剂,双丙氨膦作为筛选剂时为最佳遗传转化条件。通过该优化体系已获得多种转基因玉米材料,表明该体系具有较高的可重复性和可靠性。     

上西早生柿ACC氧化酶的转基因研究

为了得到耐贮藏的转基因柿,以上西早生柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC氧化酶的RNAi遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的壮观霉素浓度为30 mg/L,预培养时间为3 d,用OD600值为0.3的菌液侵染10 min、AS浓度100 mg/L、共培养4 d有利于提高转化频率。经PCR分子检测与GUS组织化学染色,初步确定ACC氧化酶基因已转入上西早生柿组培苗中。     

农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化

[目的]探讨魔芋愈伤组织培养基、不同转化条件(菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间)及转化植株的筛选条件(抗生素浓度和乙酰丁香酮(AS)浓度)等因素对转化效率的影响。[方法]采用卡那霉素抗性基因为选择标记,对农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系进行优化。[结果]在预培养2 d,用OD600为0.6的菌液侵染30 min、共培养3 d,卡那霉素100 mg/L,羧苄青霉素250 mg/L,AS浓度100μmol/L的条件下能有效提高转化效率。再生花魔芋植株经GUS染色及PCR检测,结果表明外源目的基因已经整合到花魔芋基因组中。[结论]为魔芋抗病品种的转基因培育,丰富其种质资源,寻找抗病新途径提供理论依据和试验基础。     

影响农杆菌介导朝仓花椒遗传转化因素研究

为建立农杆菌介导的朝仓花椒遗传转化体系,以朝仓花椒叶柄及茎段为转化受体,研究了预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间、共培养时间等因素对转化效率的影响。获得转化体系如下：外植体预培养3d,在OD600为0.5～0.8菌液侵染10min,共培养3d,延迟7d筛选,以30和50mg/L卡那霉素（Kan）进行梯度筛选。结果表明：...     

杉木遗传转化中抗生素种类和浓度的筛选

【目的】筛选适用于农杆菌介导的杉木遗传转化的抗生素种类和浓度,为杉木遗传转化体系建立提供理论依据。【方法】以杉木组培苗茎段和嫩芽为材料,探讨了潮霉素、卡那霉素和头孢霉素对其生长的影响以及对农杆菌GV3101的抑菌效果。【结果】潮霉素浓度为40 mg/L和60 mg/L时,杉木嫩芽和茎段培养42 d存活率分别为8.78%、13.97%和7.05%、5.93%,表现出良好的效果;80 mg/L时,其生长完全被抑制。卡那霉素浓度为100 mg/L时,杉木嫩芽和茎段在80 d时存活率仍高达75.04%和80.37%。300 mg/L的抗生素抑菌剂头孢霉素能有效抑制农杆菌GV3101生长,且该浓度下杉木嫩芽及茎段增殖效果良好。【结论】在以杉木嫩芽和茎段为受体材料的遗传转化体系中,40~60 mg/L和60~80 mg/L的潮霉素可作为杉木遗传转化抗性苗二次筛选的选择压,300 mg/L头孢霉素可作为农杆菌GV3101的抑菌浓度。     

花生上胚轴为外植体的植株再生及转化研究

以8 d龄花生无菌苗的上胚轴为外植体,进行植株再生和农杆菌介导遗传转化研究.结果表明,上胚轴能高效诱导花生植株再生,外植体在MS 3 mg/L TDZ 6 mg/L 6-BA 1.5 mg/L NAA培养基上能高效诱导不定芽分化,10 d时诱芽率达100%;不定芽接种到MS盐 B5维生素 3mg/L TDZ 0.01%酵母粉培养基中15 d诱导出大量丛生芽;MS 0.5 mg/L NAA培养基较适合诱导丛生芽生根,25 d时生根率达82%.筛选确定35 mg/L潮霉素浓度为转化筛选压,以含AtRD29Ap::GUS融合基因的根癌农杆菌侵染8 d龄上胚轴10 min,共培养3 d,经上述再生体系,以潮霉素筛选获得1株拟转化再生植株.     

根癌农杆菌介导欧美杨108遗传转化体系的优化

[目的]优化根癌农杆菌介导的欧美杨108遗传转化体系。[方法]以欧美杨108无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行优化研究。[结果]试验获得的优化转化体系如下:农杆菌介导欧美杨108遗传转化的潮霉素最佳叶片分化浓度为2mg/L,生根浓度为1 mg/L。优化筛选的最适转化条件为:预培养48 h,菌液浓度OD600为0.4,侵染15 min,共培养48 h。试验共获得18个抗性愈伤和抗性芽,转化频率为4.3%;经PCR检测初步证明TCS基因已整合至欧美杨108再生植株中。[结论]该研究建立了高效欧美杨108叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

葡萄叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

本研究以优良无核葡萄品种莫利莎葡萄试管苗为试材,研究了卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）对葡萄继代苗生长和离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）对葡萄离体叶片再生的影响,以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。试验结果表明葡萄继代苗对Hyg的敏感性强于Kan,葡萄遗传转化更适合使用潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记。Hyg 3.0mg/L即达到继代苗致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度,Hyg 0.8mg/L完全抑制叶片不定芽的分化,可作为叶盘法转化时抗性芽的选择压。葡萄叶盘法基因转化中抑制农杆菌生长的抗生素可选用Cef 300mg/L或Carb 400mg/L,但对不定芽的分化有抑制作用。     

抗生素对水生植物小对叶外植体分化的影响

[目的]研究小对叶对常用的抗生素的敏感性。[方法]将培养2周的小对叶无菌苗叶片切成0.5 cm×0.5 cm的小块,在添加不同浓度梯度的卡那霉素、潮霉素、壮观霉素和氯霉素4种抗生素的MS1培养基上进行培养,诱导其分化出芽,研究了4种抗生素对小对叶外植体分化的影响。[结果]一定浓度的抗生素对小对叶离体叶片的分化均具有抑制作用;确定了4种抗生素作为小对叶遗传转化研究的筛选标记的适宜浓度:卡那霉素为15 mg/L,潮霉素为10 mg/L,壮观霉素为60 mg/L,氯霉素为20 mg/L;小对叶对4种抗生素的敏感程度为:潮霉素>卡那霉素>氯霉素>壮观霉素。[结论]在进行遗传转化之前,对待转化材料进行抗生素敏感性测定是建立小对叶遗传转化系统的必然条件。     

细枝木麻黄组织培养和转基因研究

[目的]对细枝木麻黄进行组织培养和转基因研究。[方法]以耐寒性细枝木麻黄为试验材料,探讨了转化受体选择压力、菌液浓度、共培养时间在愈伤组织诱导及不定芽分化方面对农杆菌介导转基因转化效率的影响。[结果]对细枝木麻黄不定芽诱导分化适宜的激素组合为DCR+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;转基因抗生素选择压力为潮霉素,共培养时间3 d;以初步建立的转基因体系利用农杆菌介导法获得94株转基因木麻黄,通过PCR检测,其中61株为PCR阳性植株。[结论]该研究为细枝木麻黄的组织培养和转基因研究奠定了基础。     

根癌农杆菌介导致病疫霉转化体系的建立

为建立低成本、快速、高效的根癌农杆菌介导的致病疫霉转化体系,以菌株 HK0919为材料,从抗生素筛选浓度、共培养转膜方式、乙酰丁香酮（AS）浓度、共培养时间和共培养温度等方面对致病疫霉的转化体系进行了研究。综合各因素优化结果,建立的转化体系条件为：以1．0μg/mL的潮霉素B进行转化子筛选,采用玻璃纸作为共培养介质,AS浓度为200μmol/L,培养6 d,温度为22℃。在此条件下的转化效率为每106个游动孢子获得50～60个转化子。随机选取10个转化子,利用特异性引物对潮霉素抗性基因hph进行PCR扩增,转化子均能扩增出800 bp左右的预期条带;同时,利用根癌农杆菌vir基因特异引物对转化子进行 PCR扩增,排除了转化子被农杆菌污染所致的假阳性;转化子继代培养5代后,仍能在含潮霉素 B的黑麦培养基上生长。说明外源T DNA已成功整合到致病疫霉基因组中,并能稳定遗传。     

农杆菌介导的木薯遗传转化体系的优化

以木薯腋芽为外植体,通过添加不同含量的2,4-D和picloram摸索诱导体细胞胚及FEC的最佳激素条件;利用优化的再生体系,以木薯脆性胚性愈伤组织(FEC)为受体,对农杆菌侵染FEC的侵染浓度、侵染时间以及侵染后潮霉素抗性筛选浓度进行了研究。结果表明,12 mg·L~(-1)的picloram能较快诱导出体细胞胚及FEC;农杆菌菌液浓度OD600=0.4并侵染30 min为FEC转化效率及植株再生率的最佳条件;共培养后,通过逐渐增加潮霉素筛选浓度(0,5,8,15 mg·L~(-1))能更有效地提高植株的再生率。     

花椰菜高效再生体系建立及农杆菌介导的遗传转化研究

以栽培品种"银峰80天"的下胚轴与子叶为外植体,建立花椰菜高效组织再生体系,并研究卡那霉素浓度、侵染时间和共培养时间等因素对花椰菜愈伤组织分化的影响。结果表明:以MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA0.1mg/L作为分化培养基时,下胚轴的分化频率达88.9%,子叶的分化频率达97.6%;农杆菌介导花椰菜遗传转化时,OD600=0.4,下胚轴和子叶的侵染时间为1 min,下胚轴和子叶分别共培养1 d和3 d后进行筛选,有利于花椰菜再生芽的分化获得抗性苗。     

番茄果实ABA合成酶NCED基因的克隆及其RNAi遗传转化体系的建立

以番茄为材料,根据ABA合成关键酶编码基因NCED的保守序列设计引物,通过RT-PCR方法从番茄果实中克隆了2个NCED基因片段,Le NCED1和Le NCED2。通过农杆菌介导法进一步建立了‘嘉宝’番茄Le NCED1基因的RNAi再生和转化体系,并研究影响番茄遗传转化的4个因素外植体类型、预培养时间、激素组合、农杆菌侵染时间。结果表明:番茄子叶预培养2 d,用农杆菌LBA4404侵染5 min后,避光共培养2 d,在加入1mg/L 6-BA+0.05 mg/LIAA+5 mg/L潮霉素的MS培养基上可以诱导出芽,转入添加0.1 mg/LIAA+7 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上可以使芽生根。本实验共获得26株抗性植株。GUS染色证明,有9株抗性植株成功转入含有NCED基因RNAi载体的T-DNA,为深入了解ABA促进番茄果实成熟的机理提供了方法和材料。