双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白（PrP）基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽（九肽）重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸（除LT200302为23个氨基酸外）的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物，采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因，序列分析结果表明，所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678bp、编码226个氨基酸的前体蛋白，其核苷酸序列的同源性为99．79％以上，发现了4个核苷酸多态性位点，无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较，与猫（AF003087，96．7％）和绵羊（96．2％）的氨基酸同源性最高。     

梅花鹿朊蛋白基因(PRNP)的克隆及序列分析

根据GenBank中鹿朊蛋白基因序列设计特异性扩增引物，采用PCR方法从中国梅花鹿基因组中扩增得到梅花鹿的朊蛋白基因，采用PCR产物直接测序，并将其克隆到pGEM—TEasy载体中测序进行进一步确认，通过分析表明所克隆的梅花鹿朊蛋白基因的ORF基因片段包含771bp，编码256个氨基酸的前体蛋白，相对分子质量约为28200。与已报道的其他品种鹿朊蛋白基因序列进行对比分析，核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98％以上。本试验为进一步研究中国梅花鹿朊蛋白的多态性提供了数据。     

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板，运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因，运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明，获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内，与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性，达99．0％。牛与绵羊Prnp基因同源性为97．3％，推导氨基酸序列同源性为96．5％。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86．7％和87．1％，其氨基酸序列的同源性均为90．0％。3种Prnp基因均有富含G—C的重复区，编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPI锚结合位点组成。基因型分析表明，秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。     

牛朊蛋白(bPrPc)基因的克隆和序列分析

分别从9头牛(3头牦牛、3头荷斯坦牛和3头秦川黄牛)全血中提取基因组总DNA，用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrP^c)基因，并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的牛PrP。的片段大小为795bp，包含了牛朊蛋白基因的完整编码区序列，为含单一外显子的完整开放阅读框，与国内外报道的已知序列基本相同。本次所报道的牛PrP(bPrP^c)基因含6个短而富含G-C的元件，可编码八肽Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln／Arg或九肽Pro-Gin／His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp／Arg-Gly-Gin。这些bPrPC基因序列相比较，其核苷酸和氨基酸同源性分别在99．0％～100．0％和99．2％～100．0％之间。在整个18个碱基替换中，多数替换是保守的，为同义突变，仅有5个替换引起氨基酸突变，分别为HN200302的W60R、HN200303的S154N、MN200301的A129V、NN200302的Q234R和NN200303的Q94R突变。发现牦牛朊粒基因在126(A-G)、234(G-A)和678(T-C)位的特征性核苷酸替换，但均为同义码替换。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA，用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因。测序分析表明，所克隆的羊PrP^c基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21（DE3），挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达，收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明，PrP基因在大肠杆菌中成功表达，并能被抗牛PrP^c单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示，表达蛋白约占菌体总蛋白的309／6～45％，目的蛋白以包涵体的形式存在，包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

杂交牛(大额牛×云南黄牛)朊蛋白基因 的分子克隆及其序列分析

朊蛋白(prion protein,PRNP)基因编码朊蛋白,是引起疯牛病的主效基因。本研究利用PCR方法首次从杂交牛(大额牛×云南黄牛)基因组中扩增了PRNP基因,GenBank登录号为HQ875337。PCR产物直接双向测序表明,该序列包含杂交牛PRNP基因795 bp的开放阅读框(ORF),编码264个氨基酸前体蛋白。生物信息学分析结果发现,该蛋白包含1个信号肽、3个α螺旋、2个β折叠、6个八肽重复序列、1个疏水区域、1个二硫键和1个糖基磷脂酰肌醇锚定位点。与已报道的其他牛PRNP基因进行序列比对分析,核苷酸和氨基酸的同源性均在97%以上。     

牛、羊、人叠朊基因的克隆与分析

为了解我国哺乳动物叠朊基因Prnd的生物信息，本实验采用PCR方法克隆了秦川黄牛、甘肃土种绵羊和汉族人的Prnd，运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明，获得的三种哺乳动物的Prnd均位于1个单一的外显子内，与GenBank登录的相应序列具有高度同源性。秦川黄牛与甘肃土种绵羊Prnd的同源性为96．8％，推导氨基酸序列同源性为93．3％。汉族人Prnd与秦川黄牛和甘肃土种绵羊Prod的同源性均为80％，推导的氨基酸序列同源性均为76．3％。氨基酸一级结构分析显示3种Prod编码的叠朊均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPI锚结合区组成。二级结构预测表明，3种Prod编码的叠朊均由3个α-螺旋和2个β-片层组成。本研究获得的这3种主要哺乳动物的Prnd信息为一进步研究叠朊的结构与功能奠定了基础。     

中国黄牛PrPc成熟蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的PrP^c蛋白基因序列，设计合成一对引物，并在2个引物的两端分别加入Bam HI和Nde Ⅰ酶切位点。以从中国黄牛肝脏中提取的基因组DNA为模板，经PCR扩增出一约640bp的目的基因片段，将此基因克隆于pET11a载体，构建了PrP^c蛋白基因重组质粒b-pET11a-PrP^c，转化DH－5α并进行序列测定。同源性分析表明：中国黄牛PrP^c成熟蛋白基因与目前国外发表牛的成熟蛋白PrP^c基因相比，有较大差异，发现了一个新的NdeⅠ酶切位点；推导的氨基酸序列有4个氨基酸差异，缺少一个8氨基酸重复区。     

藏绵羊乳腺乳铁蛋白的克隆及序列分析

本研究以四川若尔盖县藏系绵羊为材料,利用RT-PCR方法扩增并克隆了藏绵羊乳铁蛋白(lactoferrin,LF)序列,运用生物信息学软件对其核苷酸序列和编码蛋白质的结构进行预测和分析。结果表明,克隆的LF基因全长2127 bp,共编码708个氨基酸,N端有19个氨基酸组成的信号肽,该蛋白质等电点为8.4,预测分子质量为77.2 ku;半定量RT-PCR分析结果表明,LF在乳腺、气管、淋巴、肝脏、泪腺和脾脏中都有表达,在肺脏中不表达。本试验克隆了藏绵羊LF cDNA全序列,并对LF和乳铁蛋白肽(lfcin,Lfc)核苷酸和蛋白质进行了分析,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

山羊KIFI基因分子克隆及序列分析

利用Primer 3.0设计出1对特异性引物F和R,以成年山羊基因组DNA为模板,扩增山羊的KIFI基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化后挑取阳性菌落进行酶切及测序鉴定。结果表明,克隆所得的472 bp序列(GenBank登录号:GQ988385),包括山羊KIFI基因的Exon 1全长、部分5′UTR和部分Intron 1序列。山羊KIFI基因的Exon 1序列编码116个氨基酸,与绵羊、牛、马、人和家鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和84%。KIFI基因部分序列的克隆,为进一步研究KIFI基因多态性与绵、山羊绒用性能间的相关性奠定基础。     

Cloning and Sequence Analysis of MFN2 Gene from Boer Goat

Mitofusin-2 (MFN2), an outer transmembrane protein on the mitochondrion, which was a signaling and therapeutic target molecule, played a critical role in cell proliferation, differentiation, apoptosis and many diseases.For further researching the molecular mechanism of MFN2 gene in inflammatory disease, the MFN2 gene from Boer goat was cloned by RT-PCR, and its sequence and coding protein structure were analyzed.The results showed that the full length of MFN2 gene was 2 441 bp and its coding protein was composed of 705 amino acids.It was low homology between species with conservative protein structure, Fzo-mitofusin structural domain and DLP-2 structural domain, respectively.The MFN2 had a potential transmembrane domain, and was consist of 576 to 595 amino acid without signal peptide.It was the first time to clone MFN2 gene from Boer goat, which provided basic data for exploring the molecular mechanism of the relationship between MFN2 gene from Boer goat and inflammation.     

波尔山羊线粒体融合蛋白2基因的克隆及序列分析

线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,MFN2)是位于线粒体外膜上的跨膜蛋白,也是外膜的信号分子和药物作用靶蛋白,它在细胞增殖、分化、凋亡和多种疾病中起着重要作用。为深入研究山羊MFN2基因在炎症疾病过程中的分子作用机制,本试验采用RT-PCR的方法克隆了波尔山羊MFN2基因,并对其进行了序列测定及其编码蛋白的结构分析。结果显示,克隆得到的波尔山羊MFN2基因大小为2 441 bp,其编码的蛋白由705个氨基酸组成。波尔山羊MFN2基因种间同源性低,存在Fzo-mitofusin结构域、DLP-2结构域,是结构保守蛋白;存在1个潜在跨膜区,位于576—595位氨基酸(loop1);不存在信号肽。试验首次克隆了波尔山羊MFN2基因,为探索山羊MFN2基因与炎症发生之间关系的分子机制提供了基础数据。     

Effect of condensed tannin ingestion in sheep and goat parotid saliva proteome

Saliva appears as a defence mechanism, against potential negative effects of tannins, in some species of animals which have to deal with these plant secondary metabolites in their regular diets. This study was carried out to investigate changes in parotid saliva protein profiles of sheep (Ovis aries) and goats (Capra hircus), induced by condensed tannin ingestion. Five Merino sheep and five Serpentina goats were maintained on a quebracho tannin enriched diet for 10 days. Saliva was collected through catheters inserted on parotid ducts and salivary proteins were separated by two-dimensional gel electrophoresis. Matrix-assisted Laser desorption ionization - time of flight (MALDI-TOF) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were used to identify the proteins whose expression levels changed after tannin consumption. Although no new proteins appeared, quebracho tannin consumption increased saliva total protein concentration and produced changes in the proteome of both species. While some proteins were similarly altered in both species parotid salivary protein profile, sheep and goats also presented species-specific differences in response to tannin consumption.     

藏系绵羊MSX2和HOXA4基因的克隆与序列分析

对藏系绵羊的同源异型基因家族的两个成员（MSX2和HOXA4基因）进行克隆测序,为其功能分析奠定基础。从藏系绵羊皮肤中提取总RNA,采用常规的基因克隆方法,获得了MSX2和HOXA4基因编码区序列,长度分别为804 bp和552 bp。序列比对显示,MSX2基因与预测的绵羊序列存在多个碱基差异;藏系绵羊HOXA4基因与预测的山羊序列间只有1个碱基差异,但与绵羊的预测序列差异大。     

山羊FSHR基因第10外显子序列的克隆与比较研究

根据牛FSHR基因序列设计引物,以波尔山羊和莱芜黑山羊基因组为模板,应用PCR技术克隆测定了FSHR基因第10外显子序列,并与牛该区段序列进行了比较研究。结果表明,PCR扩增获得的片断为1643bp,三畜种FSHR基因第10外显子长均为1233bp。莱芜黑山羊和波尔山羊的第10外显子序列与牛该序列相比,同源性分别为97.49%和97.41%,分别在31个和32个位点发生碱基突变。均引起10处氨基酸密码改变。波尔山羊该序列与莱芜黑山羊的比,同源性为99.60%,且3个位点有碱基突变,其中 1184和 1365位点突变引起氨基酸密码改变。     

Cloning and Sequence Analysis of Mongolian Sheep Brachyury Gene

In order to study Mongolian sheep Brachyury gene DNA sequence, main purpose of this article by using the method of PCR, DNA sequence of Mongolian sheep Brachyury gene cloning and the complete Brachyury gene sequences were obtained for the first time.The sequencing with NCBI BLAST function on the site, comparing the results with the published sequences of sheep Brachyury homology was as high as 99%.We compared these sequences with ten Brachyury genes of human, mouse and other animals in GenBank database.The results showed that the most sequences were identical.Mongolian sheep Brachyury shared a 96.30% amino acid homology with Bos taurus, the highest degree of homology indicated a close genetic relationship, and the Caudata had the lowest homology 58.45%.It could be further confirmed by phylogenetic analysis.Moreover, the results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequence of amino acids and other vertebrates Brachyury gene sequence of amino acids were highly conservative.The research results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequences and other vertebrates Brachyury gene sequences were highly conservative.