北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

杨树木质部特异启动子MDCesAP的改造及功能检测

木质部特异表达的强启动子有助于外源目的基因在植物木质部中高效表达。将2个杨树木质部特异启动子MDCe-sAP串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建成pDMDCesAP-GUS植物表达载体,通过农杆菌介导,并采用叶盘法转化烟草,获得烟草抗性植株。β-葡糖醛酸酶(GUS)活性检测结果表明,该串联启动子DMDCesAP具有木质部特异性,有望应用于桑天牛寄主树种的抗虫转基因研究。     

PRRSV河南地方分离株ORF 2～6基因的克隆与序列分析

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的ORF2-6基因的核苷酸序列,设计合成4对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV河南地方株(命名为HN-2株)的ORF 2～6片段,克隆到pUC-57T栽体并进行测序.应用DNAStar序列分析软件对分离株的ORF 2～6基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的9个PRRSV毒株进行了同源性比较,结果表明:该分离株的ORF 2～6基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%～98.1%和81.4%～96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.9%～61.9%和44.2%～45.0%;同时将分离株ORF 2～6基因的推导氨基酸序列与7个美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了该分离株ORF 2-6基因发生了变异.     

山羊DCT基因启动子活性区及其转录因子调控探究

旨在探究山羊DCT基因启动子活性区及相关转录因子对该基因的调控作用,为山羊DCT基因的表达调控提供理论依据。通过对山羊DCT基因5′侧翼区序列及第一外显子区序列进行生物信息学分析,并与人和小鼠DCT基因启动子序列进行比对,同时结合在线启动子预测结果,采用快速克隆的方法构建5个5′系列缺失序列的启动子报告基因载体,以此为基础构建3′缺失序列的6个报告基因载体,并构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂盒检测缺失片段和点突变片段的启动子活性。结果表明,成功构建了山羊DCT基因11个不同长度的启动子报告基因载体,-990~+232bp的P3片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01),基于P3构建的3′系列缺失片段中-881~-154bp的P8片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01)。转录因子SOX10结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著降低(P0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著增强(P0.01)。山羊DCT基因启动子核心调控区位于-881~-154bp区域,转录因子SOX10对山羊DCT基因发挥正调控作用,而转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因的调控作用尚需深入研究。     

中国荷斯坦牛C4A基因5'侧翼区功能分析

利用在线预测软件对牛C4A基因的5'侧翼区序列进行生物信息学分析,成功构建了一系列表达载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析牛C4A基因的5'侧翼区启动活性。分别通过定点突变技术构建突变质粒,研究调控C4基本表达和诱导表达的转录因子结合位点。利用EMSA技术验证转录因子在研究细胞系中存在与否。结果显示,C4A基因启动子序列转录起始位点上游169 bp为报告基因荧光值最高的片段,即为启动子核心区;其中SP1(-169~-158)、E-box(-122~-117)和AP-1(-80~-71)是调控C4基本表达的主要转录因子结合位点,且3个转录因子在Hep G2细胞系中真实存在。     

胸膜肺炎放线杆菌Apxll毒素的基因序列特征

为了深入地了解胸膜肺炎放线杆菌(APP)分泌的ApxⅡ毒素的分子结构及序列特征,本实验以一株APP 7型现地分离株L25-4株为实验材料,对其分泌的ApXⅡ毒素的结构基因apxⅡA及其上游启动子区进行了PCR扩增和测序。结果表明APP7型L25-4株apxⅡA基因与其它血清型apxⅡA基因核苷酸序列同源性达99．5%以上,氨基酸序列同源性达98．5%以上。在ApxⅡA蛋白的N末端有3个大的疏水结构域,分布在240～422位氨基酸之间。在ApxⅡA蛋白的C末端有富含甘氨酸(Gly)和天门冬氨酸(Asp)的九肽(nonapeptides)重复序列Leu/Ile/Phe-Xaa-Gly-Gly-Xaa-Gly-Asm/Ssp-Asp-Xaa,串连重复9次。这些结构域的起始氨基酸的位置分别为374、503、630、735、753、762、771、780和802。推定的赖氨酸酰基化作用位点为557位氨基酸,与E．coli的HlyA相比,在688位氨基酸处少了一个赖氨酸酰基化作用位点。apxⅡA基因启动子-10区序列为AATAAT,-35区序列为TTAAT,-10区与-35区间隔序列为11个碱基。     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

几个杨树木质部特异启动子片段表达载体的构建与功能分析

木质部纤维素合酶基因(CesA)在植物正常生长期的木质部特异表达,受到外界压力时可诱导在韧皮部表达,因而被用作杨树抗桑天牛转基因研究中的特异性表达启动子。将前期分离的CesA上游DNA片段JCesAP、YCesAP和MDCesAP分别替换植物表达载体pCAMBIA1302中的组成型启动子CaMV35S,构建成新的植物组织特异性表达载体pJCesAP-GFP、pYCesAP-GFP和pMDCesAP-GFP,然后采用农杆菌介导法转化烟草,均得到完整的再生烟草植株。经PCR初步检测证明目的基因已整合到烟草基因组中。荧光检测JCesAP、YCesAP和MDCesAP片段均能启动GFP蛋白的表达,在395 nm激发光下出现黄绿色荧光,显示3个CesA片段均具有在木质部特异表达的启动子活性。     

水貂DCT基因5′ UTR克隆分析与启动子活性探究

旨在克隆获得水貂DCT基因5′UTR序列并分析其结构特征,预测转录调控元件并检测启动子活性,为探究DCT基因在调控水貂毛皮颜色形成中的作用提供理论依据。本研究利用PCR扩增黑貂、白貂和咖啡貂DCT基因5′UTR,构建咖啡貂DCT基因5′UTR的pGL3-1～pGL3-7和黑貂pGL3-4～pGL3-6缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒,检测各片段的启动子活性;利用亚硫酸氢盐法检测3种毛色水貂DCT基因启动子区CpG岛甲基化水平。结果,克隆获得水貂DCT基因长8 203 bp的5′UTR序列,发现g.7133-7336为长204 bp的转座元件,与其高相似度的100条序列中,一条为蜕皮动物总门线虫纲的索巴利吸虫,其他均来自犬形亚目。P3和P4片段具有显著的启动子活性(P<0.05);咖啡貂的CpG岛甲基化水平显著高于黑貂和白貂(P<0.05);咖啡貂CC单倍型启动子活性显著低于黑貂的TT单倍型片段(P<0.05)。结果表明,水貂DCT基因5′UTR长204 bp的犬形亚目特异短散在元件Can-SINEs由蜕皮动物门的索巴利吸虫侵入动物基因组形成;基因上游32 bp元件和近端域共同作用发挥启动子活性,而GC-box和CpG岛结构沉默水貂DCT基因启动;g.-684和g.-621位点的T> C突变形成的CC单倍型导致咖啡貂DCT基因的高甲基化与低启动子活性,从而抑制真黑素合成,产生咖啡色被毛特征。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

杨树花的饲用及药用价值

杨树花为杨柳科植物毛白杨(Populus tomentosa Carr.)、加拿大杨(Populus canadensis Moench.)或同树种植物的干燥雄花序。中国杨树种植面积大,杨树花产量较高。杨树花中含有丰富的氨基酸、无机元素、蜜糖可以弥补部分饲料中氨基酸和无机元素的缺乏;通过乙醇回流从杨树花中提取的活性化合物具有良好的抗菌活性,并能够增强机体的抗氧化能力;杨树花可替代部分日粮,降低禽畜发病率,提高经济效益;其制剂对家畜肠道疾病具有良好防治效果。     

加拿大披碱草、肥披碱草及其杂种F1 RAPD分析

利用RAPD技术对加拿大披碱草(Elymus canadensis L.)和肥披碱草(Elymus excelsus Turcz.)及其杂种F₁的遗传差异性进行研究,从153个随机引物中筛选出16个适宜引物,共扩增出215个RAPD位点,多态性位点比率为72.1%,平均每条引物的多态性位点为4.3-4.8个,DNA片段长度在100-2000 bp之间。加拿大披碱草与肥披碱草的遗传距离较大(0.7122),杂种F₁与父本肥披碱草的遗传距离较近(0.2329),而与母本加拿大披碱草相对较远(0.6643),杂种F₁更偏向其父本。该结果可为加拿大披碱草-肥披碱草杂种后代的育性恢复和选育利用提供依据。     

库布其沙漠8种防护林的土壤水分特征

通过野外取样,对库布其沙漠七星湖旅游专线两侧8种防护林0-100cm土层深度的土壤水分进行测定,分析了不同防护林不同土层的土壤水分变化特征及变异系数,旨在了解和掌握库布其防护林的土壤水分特征及变异规律。结果表明,0-20、20-40、40-60、60-80和80-100cm 5个土层的土壤水分随着土层深度增加逐渐增加;5个土层的土壤水分变异系数分别为0.70、0.94、0.92、0.94和0.90,土壤水分的变异系数随着土层深度增加逐渐增大。8种防护林的土壤水分从高到低依次为旱柳(Salix matsudana)+小美旱杨(Populus popular's)混交林(9.31%)旱柳纯林(8.93%)沙枣(Elaeagnus angustifolia)+沙柳(Salix psammophila)混交林(5.69%)沙枣纯林(3.31%)速生杨(Populus spp.)纯林(2.12%)速生杨+羊柴(Hedysarum laeve)混交林(1.90%)柠条(Caragana korshinskii)纯林(1.60%)羊柴纯林(1.02%);8种防护林的土壤水分变异系数为:柠条纯林(0.08)为弱变异,羊柴纯林(0.11)、速生杨纯林(0.11)、速生杨+羊柴(0.36)混交林和沙枣+沙柳混交林(0.39)为低等变异,旱柳纯林(0.64)、旱柳+小美旱杨混交林(0.67)和沙枣纯林(0.79)为中等变异。旱柳纯林、旱柳+小美旱杨混交林和沙枣+沙柳混交林是比较好的防护林配置,沙枣纯林和柠条纯林次之,羊柴纯林、速生杨纯林和羊柴+速生杨混交林3种防护林属于不理想的防护林配置。     

丹江口水库生态屏障区柑橘—小飞蓬模式净氮矿化特征

为探明水库生态屏障区典型植物群落氮矿化特征以及植物间是否存在相互作用,选取丹江口水库柑橘(Citrus reticulate)和小飞蓬(Conyza canadensis)群丛,采用室内模拟试验(25℃下培养61d),采取单一叶处理、单一根处理和根+叶混合处理,分别测定第1、3、7、14、21、31、41、51、61天的土壤氮矿化量,系统分析添加植物的土壤氮矿化特征。结果表明,1)添加植物后,土壤有机氮矿化表现出3个阶段,1-7d是土壤微生物适应期,7-41d土壤无机氮含量迅速变化,41-61d无机氮含量基本处于平衡;2)对土壤有机氮总矿化量进行方差分析,对同一器官处理,柑橘叶(GL)在整个试验期间均表现为显著(P0.05)高于小飞蓬叶(PL),柑橘根(GR)与小飞蓬根(PR)试验中期和后期差异不显著(P0.05)。同种植物间,GL与GR在整个试验期间差异显著,PL与PR除第41天外,试验期间差异显著;3)试验结束时,单一处理仅GL对土壤净氮矿化有促进作用,其它处理无效应,混合处理GL+PL和GL+PR表现促进作用,GR+PL和GR+PR无效应;4)相关性分析和主成分分析表明,植物全氮是影响土壤净氮矿化最重要的植物化学性质。总之,植物化学性质对土壤净氮矿化有重要影响,植物间混合处理是否具有激发效应受植物化学性质和培养条件等因素综合影响。     

A Fence Design for Excluding Elk Without Impeding Other Wildlife

Concentrated herbivory by elk (Cervus elaphus) can degrade vegetative communities and alter ecosystem processes. Areas severely damaged by elk are commonly protected with woven wire fence, which can exclude other animals. Complete exclusion and prevention of large mammal herbivory might not always be necessary to restore vegetative communities. We designed and evaluated a simple fence that excluded elk, but maintained access for deer and other species. We enclosed a 1-ha stand of quaking aspen (Populus tremuloides Michaux) with our fence in an area with a high density of elk. We monitored effectiveness of the fence with trackplots, animal-activated cameras, and changes in aspen stem height and density. We documented only 1 elk within the exclosure in 2 years of monitoring. Mammals that used the exclosure included beaver (Castor canadensis), black bear (Ursus americanus), bobcat (Lynx rufus), coyote (Canis latrans), deer (Odocoileus spp.), mountain lion (Puma concolor), raccoon (Procyon lotor), red fox (Vulpes vulpes), and lagomorph (Leporidae). After 1 year of protection, mean aspen stem height increased 14.5 cm more inside the exclosure than outside, but stem density in the exclosure changed little compared to outside. Our fence design effectively excluded elk and has potential for protecting a variety of resources.     

Technique of mandibular salivary gland biopsy in river otters (Lutra canadensis).

A Franklin-Silverman biopsy needle was used to obtain 2-5- x 1-2-mm mandibular salivary gland tissue samples percutaneously from nine North American river otters (Lutra canadensis). The samples were suitable for fluorescent antibody or polymerase chain reaction rabies testing. Ninety-two percent (11/12) of the biopsy procedures yielded histologically confirmed salivary gland tissue, and the remaining biopsy yielded adipose tissue. No complications were noted after 5-21 days.     

芦苇叶片化感作用对加拿大一枝黄花生长及生理生化特性的影响

采用砂培法研究了不同浓度(0, 0.025, 0.050和0.100 g DW/mL)芦苇叶水浸提液对入侵植物加拿大一枝黄花的化感效应。结果表明,在试验过程中(0~45 d),随芦苇浸提液浓度升高,加拿大一枝黄花基径和株高的累积生长量显著下降,死亡数随浓度升高明显上升;叶绿素含量随处理时间持续降低,且浓度越高叶绿素含量越低,而类胡萝卜素含量则呈先升高后降低之势;低浓度时,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性随处理时间持续上升,但当浓度继续升高,则二者均呈先升高后降低之势;过氧化氢酶活性(CAT)和丙二醛(MDA)含量随芦苇叶浸提液浓度升高而上升,且二者随处理时间呈持续升高之势;可溶性蛋白含量和根系活力随处理浓度升高而降低,且该趋势随处理时间延长而加剧。可见,随浸提液浓度升高和处理时间延长,芦苇对加拿大一枝黄花化感胁迫效应增强。     

3株表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力比较

作者旨在探讨鸡痘病毒ORF073或ORF214基因缺失后,在母源抗体存在情况下对重组病毒免疫效力的影响。将构建好的在ORF073或ORF214基因插入H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)及单表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)分别免疫SPF鸡和商品鸡,检测重组疫苗诱导的免疫效力。结果:3种重组鸡痘病毒在SPF鸡产生较高的HI抗体效价及100%的免疫保护;在HI母源抗体效价为2.45的商品鸡体内基因缺失株重组病毒比rFPVLP-12LSH5A易于清除,抗体上升缓慢而且免疫28 d后HI抗体效价较低,免疫保护率低,分别为16.7%和23.3%;在母源HI抗体效价为0的商品鸡体内基因缺失株重组病毒免疫后产生的抗体效价高,免疫28 d后分别达到3.50和3.17。结果表明在商品鸡体内母源抗体影响下,缺失ORF073或ORF214基因的重组鸡痘病毒的免疫效力降低。     

高效液相色谱法测定环丙氨嗪的含量

建立了环丙氨嗪含量测定的高效液相色谱方法。采用Phenomenex Prodigy C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),甲醇:乙腈:缓冲液(每1000mL水中加3.72g磷酸氢二钾和6.48g磷酸二氢钾)=5:2:93为流动相,流速为2.0mL/min,检测波长214nm,柱温20℃。该方法线性范围为0.00799～0.01229mg/mL,r=0.99,系统精密度RSD=0.25%(n=6),平均回收率为99.2%(RSD=0.82%)。