ELISA双抗体夹心法检测幼犬轮状病毒的研究

应用ELISA双抗体夹心法对幼犬轮状病毒感染情况进行调查,结果表明兰州地区幼犬轮状病毒感染阳性率为57.1%,其中2～4月龄的幼犬占阳性病例的75.0%,而2月龄以内及大于4月龄的犬感染轮状病毒的病例较少。     

应用ELISA双抗体夹心法检测＼猪细小病毒抗原的研究

研究建立了从胎猪脏器中检测猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法。试验方法的最侍工作条件为，抗体浓度１：４００，酶标抗体浓度１：５０。５４份胎猪样品阳性检出率为５９．３％，不同脏器的阳性检 出率分别为，心３６．４％、肝脏７２．２％、肺脏６６．７％、肾脏６６．７％。     

应用ELISA双抗体夹心法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

本试验建立了检测鸡病毒性关节炎病毒的ELISA双抗体夹心法.取代反应、阻断试验均为阴性,与NDV、MDV和IBDV无交叉反应,对已知阳性标本的检测均为阳性;其敏感性比琼扩试验高80倍以上,这表明ELISA夹心法具有较高的特异性和敏感性.在人工感染后2～27d,关节滑膜、腱鞘和脾脏中病毒检出率为100％;还从肝脏、法氏囊和脑组织中检测到病毒.     

牛附红细胞体病双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

用过碘酸钠改良法制备酶标抗体,建立了从血液中检测奶牛温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA。试验结果表明:抗体最适包被量为156μg/mL;酶标抗体最适工作浓度为1∶400;抗原及酶标抗体的作用温度和时间分别为37℃、1 h;封闭液为5%犊牛血清;底物显色时间为15 min;对温氏附红细胞体抗原的最低检出量为6.64μg/mL;全血及带有附红细胞体的红细胞与纯化抗体反应的最大稀释倍数分别为1∶160和1∶40,可按照此浓度检测血液中的附红细胞体抗原。对该方法进行特异性阻断试验、交叉性试验和重复性试验,结果表明此法是一种特异、灵敏、快速的诊断方法,并适合作群体检测。     

双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ,试验方法的最佳工作条件为：抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１：２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体,脑和肺的检出率最高,其次为心,肝,脾,肾等组织。     

双抗体夹心阻断ELISA检测血清中牛病毒性腹泻-粘膜病病毒抗体的研究

本研究建立了检测血清中牛病毒性腹泻-粘膜病(BDV-MD)病毒抗体的双抗体夹心阻断ELISA,并用其检测了长春地区293头奶牛和262头黄牛的血清.结果,奶牛的阳性率为54.9％.黄牛的阳住率为43.5％.本方法是一种敏感、特异、快速的检测抗体方法,可在基层推广应用.     

应用双抗体夹心ELISA法诊断棘球绦虫感染的试验

棘球绦虫是世界范围内广泛分布的一种人畜共患寄生虫病，在我国主要分布在西部的新疆、青海、甘肃、宁夏、四川等地，青海省属于棘球绦虫的高发流行区。在青海的草原牧场上除了依赖草地生存的各类家畜外，同时栖息着野生草食动物、肉食动物及与牧民朝夕相处的动物——藏獒。     

双抗体夹心ELISA检测牛病毒性腹泻病毒的研究

建立了从粪便中检测牛病毒性腹泻（ＢＶＤ）病毒抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为，抗体包被量为１００μｇ／孔，酶标抗体的浓度为１：４００。对不同地区牛、羊、鹿粪样检测结果，牛的ＢＶＤＶ感染率为１６．５％￣８９．０％，羊为１４．６％￣８３．３％，鹿为１９．６％￣４４．４％，并且从许多地区的牛、羊同时检测到ＢＶＤＶ，表明本病在国内某些地区存在着严重的感染。     

双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为,抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体、脑和肺的检出率最高,其次为心、肝、脾、肾等组织。     

应用双抗体夹心法ELISA检测IBDV的研究

从抗ＩＢＤＶ高免蛋黄液中提取ＩｇＧ，用作包被抗体和酶标记，建立了检测ＩＢＤＶ的双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ。经抗原阻断，无关病毒对照、取代、验证等项试验，并与常规ＡＧＰ法比较，对来源不同的１００多个样品进行检测，结果表明：该法对患鸡腔上囊、脾脏的检出率均为１００％，比ＡＧＰ法敏感１００倍以上，用肉眼观察阳性与阴性之间颜色差异显著，不存在非特异性反应。试验证明该法具有满意的待异性、敏感性、快速性和稳定性，是ＩＢＤ早期病原学诊断和流行病学调查的有效手段。     

禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法.该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性.与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P＞O.17为阳性判定标准.应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%.     

双抗体夹心ELISA方法快速诊断奶牛附红细胞体病探讨

附红细胞体病是一种人畜共患病,不仅能引起家畜家禽发病、生产性能降低甚至大批死亡,而且直接危害人身健康。2005年8月,河北省某奶牛场有1头奶牛发生了以贫血、黄疸、体温升高为主要特征的疾病,经用抗生素及中药补血治疗,未见好转,后据临床症状和血液涂片镜检初步诊断为附红细胞体病。为进一步确诊,进行了双抗体夹心ELISA试验。1材料和方法1.1试验材料纯化的兔抗牛附红细胞体抗体、酶标抗体及阴性抗原(河北农业大学动物科技学院寄生虫室制备)。抗体含量为5mg/ml,酶标抗体中HRP浓度(酶量)为474μg/ml,酶标结合物产率为47.4%。1.2试验方法…     

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG，采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果，抗体的最佳包被量为150μg／mL，酶标抗体最适工作浓度为1：200；封闭液为50mL／L的兔血清；待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃ 120min；底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测，结果，阳性检出率为42．6％。     

双抗夹心—ELISA诊断牛隐孢子虫病

为了建立双抗体夹心—ＥＬＩＳＡ检测牛粪便中隐孢子虫卵囊抗原的方法。采用抗小球隐孢子虫（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）卵囊壁单克隆抗体,经对６０头份牛粪便样本分别进行抗酸染色和双抗夹心—ＥＬＩＳＡ检测,结果抗酸染色法检出１２头份有隐孢子虫卵囊,而ＥＬＩＳＡ除对抗酸染色阳性的１２份粪样判为阳性外,还对抗酸染色阴性的４份粪样判为阳性,且不与牛球虫、牛结肠小袋纤毛虫发生类属反应。此外,本试验在稀释液中加入ＥＤＴＡ,并增加了反应温度,使得试验在抗体包被板并封闭后３０ｍｉｎ结束整个检测过程。结果表明,双抗体夹心—ＥＬＩＳＡ是敏感性高、特异性强的诊断牛隐孢子虫病的方法。     

检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用

以鹅源坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释度为1∶1 600,单克隆抗体的最适稀释度为1∶160,样品反应时间为1 h,酶标羊抗鼠二抗工作浓度为1∶5 000,以OD450nm≥0.245作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,病毒最低检测量为386.25TCID50/0.1 mL,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)和鹅细小病毒(GPV)无交叉反应。应用该方法与RT-PCR方法同时检测22份临床样品,符合率达到86.36%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于坦布苏病毒的快速检测。     

羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

为快速准确诊断和检测羊附红细胞体病,及时采取防治措施,建立了检测羊附红细胞体抗原的双抗夹心ELISA诊断方法。选取规模化养殖场羊,镜检附红细胞体红细胞感染率> 90%,无菌采取血液,分离羊附红细胞体抗原,制备纯化兔抗羊附红细胞体抗体,应用辣根过氧化物酶标记抗体,进行双抗体夹心ELISA试验。试验结果表明,双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:抗体最佳包被量为82.91 μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为7.81 μg/mL;而且与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌以及牛、猪、兔附红细胞体均不出现交叉反应,表明该方法具有良好的特异性,可用于羊附红细胞体病的诊断和群体检测。     

鸡传染性腔上囊病病毒双夹心ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）、小鼠抗IBDV和绵羊抗兔免疫血清,并纯化绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,采用方阵滴定法测定其最佳使用浓度,建立了IBDV双夹心ELISA检测方法。结果显示,包被抗体的最适稀释度为1：160,兔抗IBDV的最佳稀释度为1：200,酶标记抗体的最佳稀释度为1：400。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性强,重复性好,与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡减蛋综合征病毒抗原均不发生交叉反应。对人工感染病例的检测结果表明,建立的双夹心ELISA方法可用于临床快速诊断IBDV。     

猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立

本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒（CSFV）E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用 CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65 μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R²值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。