绵羊痘病毒多表位基因的构建及原核表达

通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占菌体的32%。Western-blotting试验表明,目的蛋白可被羊痘血清识别。     

绵羊肺炎支原体延伸因子EF-P基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫原性研究

为筛选绵羊肺炎支原体(MO)免疫相关蛋白,以MO新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增其EF-P基因,测序后对其编码蛋白进行分子特征分析;用生物信息学软件预测其抗原表位集中区编码片段;进一步将该基因片段克隆入pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-EF-P,将pET-32a(+)-EF-P质粒转化至感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达后,检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDS-PAGE结果显示,EF-P重组蛋白分子质量为29.5ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体,采用正向间接血凝方法检测效价可达1∶64,提示其具有较强的免疫原性。     

绵羊肺炎支原体热休克蛋白Hsp70 C末端基因原核表达

为研究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)热休克蛋白Hsp70抗原特性,以Mo贵州分离株为模板扩增得到Hsp70蛋白C末端基因,将目的基因连接至pET-28a原核表达载体,经PCR、双酶切和序列测定正确的阳性重组质粒转化E.coli Rosseta表达菌,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,经PCR从Mo贵州分离株扩增获得567bp的C末端片段,并成功构建含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达获得分子质量约为27ku的目的蛋白,且目的蛋白能与Mo阳性血清印迹反应。说明,成功构建可有效表达Mo贵州分离株Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体。     

重组轮状病毒多抗原表位的克隆、表达及植物表达载体的构建

为了研制基于表位的轮状病毒亚单位疫苗,用PCR的方法得到RV(Rotavirus RV)VP4的抗原表位编码序列,并人工合成了RV VP7的3个抗原表位编码序列,通用辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)氨基酸序列和破伤风毒素(Tetanus toxin,TT)上的一个T细胞激活位点[1,2],各位点间以非极性的甘氨酸和脯氨酸分隔以保持各表位的相对独立性,使用搭桥法PCR(Over lapextension PCR)、酶切、连接等基因工程的方法将各个表位片段串联拼接在一起,组合成一条轮状病毒(RV)多表位抗原基因,将其转入原核载体质粒pTHioHis B,在大肠杆菌DH5a克隆,并在BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量与预期结果相符;重组蛋白经轮状病毒快速检测试剂盒检测有抗原性。将此多表位抗原基因插入高效植物表达载体pE1802,为研制重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。     

新城疫病毒F蛋白结构域基因原核表达与抗原表位分析

以含新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因的重组质粒为模板,设计特异引物进行重叠-延伸PCR扩增获得F基因的抗原结构域基因片段Fa、Fb和Fa-l-Fb,经SalⅠ和NotⅠ酶切后,定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,获得重组质粒pGEX-Fa、pGEX-Fb和pGEX-Fa-l-Fb;用定点突变方法获得重组质粒pGEX-Fa-mut.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,转化菌经IPTG诱导、提取表达产物进行蛋白电泳和免疫印迹分析.结果表明:Fa-mut、Fb和Fa-l-Fb结构域基因均获得了融合表达,表达产物与NDV阳性血清具有免疫反应性;与pGEX-Fa-mut不同,pGEX-Fa重组质粒在大肠杆菌中未能表达,且转化菌在IPTG诱导过程中未见生长,提示未经突变的Fa片段可能为毒性蛋白.三维结构预测结果显示,目的蛋白片段中均保留F蛋白中原有相应的抗原表位.     

绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5株感受态细胞,用氯霉素和高温双重压力筛选得到重组菌LM-Δrli60-ap74b。并通过SDS-PAGE及Western blot分析重组菌P74蛋白的表达情况,通过小鼠免疫试验检测其免疫原性。【结果】成功扩增出了rli60基因的上下游同源片段a、b及p74目的片段,采用SOEPCR方法获得融合片段ap74b,并成功亚克隆于穿梭质粒pKSV7中。对重组菌PCR鉴定结果表明,外源基因MO p74定点整合于LM基因组中。体外稳定性检验表明,p74基因能在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b可表达蛋白分子质量约为17ku重组蛋白;Western blot分析表明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b菌液可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性,重组菌能诱导机体产生1∶8~1∶16的抗体效价。【结论】获得了具有免疫原性的绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌。     

绵羊肺炎支原体多抗原表位基因MO-meAg15重组单增李斯特菌的构建及其免疫原性研究

【目的】本文研发了MO重组活疫苗。【方法】利用PCR技术从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因上下游同源片段a、b,从pMD19-T-meAg15中扩增出MO meAg15目的片段,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将扩增得到的3个基因片段融合成ameAg15b,将其克隆测序鉴定。将ameAg15b目的基因亚克隆到pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ameAg15b重组穿梭质粒,将该重组穿梭质粒电转化至LM-SB5感受态细胞,在氯霉素、高温双重压力筛选重组菌LM-Δrli60-ameAg15b。【结果】重组菌PCR鉴定表明,外源基因meAg15定点整合于LM基因组中。遗传稳定性试验表明,meAg15基因可以在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ameAg15b可表达相对分子量为14.5 kDa的重组蛋白;Western blot分析说明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。【结论】小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ameAg15b菌体可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性。     

绵羊肺炎支原体Y-98株外膜蛋白成分分析及其免疫原性研究

采用TritonX-100裂解和0．6％KI提取的方法制备绵羊肺炎支原体Y-98株外膜蛋白，经12％SDS-PAGE分析，表明其分子量范围在14．4—125．9KD之间；分别制备抗Y-98株全细胞抗原和外膜蛋白高免血清，经Western-blotting分析，表明外膜蛋白为绵羊肺炎支原体的主要保护性抗原，而在外膜蛋白，67．6、39．3和28．8KD多肽为其主要保护性抗原。利用间接ELISA方法和MTT法对外膜蛋白引起的体液免疫和细胞免疫功能进行了测定，结果表明膜蛋白能够诱导机体产生高效价的抗体，免疫后7、14和28d效价分别达到了1：2^4.25、1：2^7.75和1：2^8.75;膜蛋白具有非特异性和特异性致有丝分裂作用，在免疫前0d及免疫后28d对T淋巴细胞刺激的转化率分别为8．46％和18．3％。     

绵羊肺炎支原体蛋白质组双向电泳图谱的构建

为了建立针对绵羊肺炎支原体蛋白质组学研究的双向电泳图谱及其相关技术体系.采用反复冻融兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解法和超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解法提取绵羊肺炎支原体菌体蛋白,取200μg菌体蛋白利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳,对硝酸银染色后获得的双向电泳图谱进行图像分析.结果表明反复冻融兼Utea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法获得198±2个蛋白斑点,超声兼Urea-CAPS-DTT-SB3-10裂解提取法获得241±2个蛋白斑点.说明超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法提高了双向电泳的分辨率,进而可增强生物质谱鉴定蛋白质的准确度.     

绵羊肺炎支原体 p113 基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.     

绵羊肺炎支原体贵州株P113基因的克隆与生物信息学分析

为获得绵羊肺炎支原体贵州株P113基因生物信息学特征,应用DNAStar、Mega 5.0、Protparam、Protscale、IEBD等工具对其(GZ-QX1株)P113蛋白特性、结构和功能进行预测分析。结果显示,绵羊肺炎支原体GZ-QX1株P113基因序列大小为3 240bp,编码1 079个氨基酸,与绵羊肺炎支原体Y98标准株、四川SC01株、猪肺炎支原体P97、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种的核苷酸序列同源性分别为99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%。P113蛋白是分子质量约119ku的碱性蛋白,具有较多优势抗原表位;蛋白结构分析显示,P113蛋白无跨膜结构,有9个N糖基化位点,59个丝氨酸、16个苏氨酸的磷酸化位点,14种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点;蛋白功能分析认为,P113可能是某信号传导通路的信号分子,也是一种具有良好抗原性的结构蛋白。     

盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响

为研究盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响,首先分离试验羊的淋巴细胞,分别将盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白和绵羊肺炎支原体加入体外培养的淋巴细胞中共同孵育,利用real-time PCR技术检测肺炎支原体16SrRNA的表达水平。结果表明,体外淋巴细胞与绵羊肺炎支原体、重组ISG15蛋白共培养12h到96h,盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平显著低于对照组(P0.05),而杂交羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平与对照组差异不显著(P0.05)。说明盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白在体外可对绵羊肺炎支原体起到抑制作用。     

棉花茉莉酸羧基甲基转移酶基因克隆及其表达分析

根据亚洲棉石系亚1号的转录组测序结果,克隆获得陆地棉品种"新陆早17号"的茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)全长cDNA,命名为GhJMT(GenBank登录号KJ856913)。序列分析表明,GhJMT基因开放阅读框为1 116bp,编码371个氨基酸。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有甲基转移酶-7保守结构域。系统进化树分析显示,GhJMT与可可的茉莉酸甲基转移酶在同一分支,可能定位于细胞质,为不稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,2.5%PEG6000胁迫处理12h时,根中GhJMT基因的表达迅速上调并达到最大值,约为对照的2.6倍,在茎中GhJMT的表达量在9h达到最高,约为对照的2.3倍,而在叶中GhJMT表达量在3h达到最高,约为对照组的2.1倍,说明GhJMT基因表达受干旱胁迫的诱导。研究结果有助于阐明GhJMT基因表达与植物抗旱的相关性。     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

Trxf1基因表达载体的构建及在加工番茄中的遗传转化

Trxf1是硫氧还蛋白家族中的一员,是组成硫氧还蛋白系统的重要组成部分,在植物的氧化逆境中发挥作用。为进一步研究该基因功能,通过RT-PCR方法从加工番茄叶片中克隆Trxf1基因的编码区,成功构建植物表达载体pBI121-Trxf1,采用农杆菌介导法转化番茄,经PCR、RT-PCR分析表明,植物表达载体已成功整合到番茄基因组中。实时荧光定量PCR研究表明,加工番茄Trxf1基因在其根、茎、叶、花等器官中均有表达,且在叶片中表达量最高。     

紫花苜蓿MsUGT73B2基因的克隆及表达

糖基化是植物体蛋白、激素等物质的常见修饰方式,对维持植物正常生长发育具有重要作用,在植物中糖基化反应由糖基转移酶催化。利用蒺藜苜蓿参考序列通过RACE法克隆得到紫花苜蓿基因MsUGT73B2的全长序列,利用生物信息学方法分析其氨基酸序列、二级结构、理化性质等,RT-qPCR分析基因表达情况,构建基因表达载体,研究亚细胞定位。结果表明,MsUGT73B2基因全长1 512bp,编码503个氨基酸,属于稳定的亲水性蛋白,序列比对结果显示其属于UGT家族基因,亚细胞定位于细胞质中。MSOGT73B2主要在紫花苜蓿叶片中表达,且干旱、10μmol/L ABA处理下在2h之前升高,之后下降;在150mmol/L NaCl胁迫处理下表现为4h之前表达水平升高,之后下降的趋势。     

鲤A-FABP基因的克隆及其表达谱研究

为探索A-FABP基因表达与鲤肌内脂肪质量分数的关联,利用RT-PCR方法克隆鲤(Cyprinus carpio)脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte fatty acid binding protein,A-FABP)基因,同时利用荧光定量PCR技术分别检测该基因在鲤不同组织和不同发育阶段的表达差异,获得其组织和时序表达谱,并将基因表达水平与肌内脂肪质量分数进行关联分析。结果获得鲤A-FABP基因开放阅读框(ORF)序列405bp,编码134个氨基酸,与多鳞白甲鱼、斑马鱼、大西洋鲑和青鳉等的氨基酸同源性关系较近(氨基酸相似性为70%~91%),与人、猪、田鼠和牦牛等哺乳动物的氨基酸同源性关系较远(氨基酸相似性为51%~58%);组织表达谱分析结果显示,A-FABP基因可在鲤的心脏、肌肉、脂肪、肝脏、脑、脾脏、肾脏和鳃中表达,并且在脂肪组织的表达量显著高于其他组织(P0.05)。发育表达分析结果显示,较小体质量试验鱼(50g)的A-FABP基因表达水平显著高于较大体质量试验鱼(120~130g和500g)(P0.05),并且其表达与背最长肌的肌内脂肪质量分数呈显著负相关。