绵羊肺炎支原体HSP70基因的克隆、表达及免疫原性分析

根据GenBank登录的MO HSP70基因序列,设计特异性引物对MO新疆分离株HSP70基因进行扩增,克隆入T载体中测序。将HSP70基因亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX4T-1-HSP70,并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为53ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组HSP70具有良好的反应原性。重组HSP70蛋白免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5株感受态细胞,用氯霉素和高温双重压力筛选得到重组菌LM-Δrli60-ap74b。并通过SDS-PAGE及Western blot分析重组菌P74蛋白的表达情况,通过小鼠免疫试验检测其免疫原性。【结果】成功扩增出了rli60基因的上下游同源片段a、b及p74目的片段,采用SOEPCR方法获得融合片段ap74b,并成功亚克隆于穿梭质粒pKSV7中。对重组菌PCR鉴定结果表明,外源基因MO p74定点整合于LM基因组中。体外稳定性检验表明,p74基因能在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b可表达蛋白分子质量约为17ku重组蛋白;Western blot分析表明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b菌液可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性,重组菌能诱导机体产生1∶8~1∶16的抗体效价。【结论】获得了具有免疫原性的绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌。     

绵羊肺炎支原体贵州株P113基因的克隆与生物信息学分析

为获得绵羊肺炎支原体贵州株P113基因生物信息学特征,应用DNAStar、Mega 5.0、Protparam、Protscale、IEBD等工具对其(GZ-QX1株)P113蛋白特性、结构和功能进行预测分析。结果显示,绵羊肺炎支原体GZ-QX1株P113基因序列大小为3 240bp,编码1 079个氨基酸,与绵羊肺炎支原体Y98标准株、四川SC01株、猪肺炎支原体P97、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种的核苷酸序列同源性分别为99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%。P113蛋白是分子质量约119ku的碱性蛋白,具有较多优势抗原表位;蛋白结构分析显示,P113蛋白无跨膜结构,有9个N糖基化位点,59个丝氨酸、16个苏氨酸的磷酸化位点,14种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点;蛋白功能分析认为,P113可能是某信号传导通路的信号分子,也是一种具有良好抗原性的结构蛋白。     

鲤A-FABP基因的克隆及其表达谱研究

为探索A-FABP基因表达与鲤肌内脂肪质量分数的关联,利用RT-PCR方法克隆鲤(Cyprinus carpio)脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte fatty acid binding protein,A-FABP)基因,同时利用荧光定量PCR技术分别检测该基因在鲤不同组织和不同发育阶段的表达差异,获得其组织和时序表达谱,并将基因表达水平与肌内脂肪质量分数进行关联分析。结果获得鲤A-FABP基因开放阅读框(ORF)序列405bp,编码134个氨基酸,与多鳞白甲鱼、斑马鱼、大西洋鲑和青鳉等的氨基酸同源性关系较近(氨基酸相似性为70%~91%),与人、猪、田鼠和牦牛等哺乳动物的氨基酸同源性关系较远(氨基酸相似性为51%~58%);组织表达谱分析结果显示,A-FABP基因可在鲤的心脏、肌肉、脂肪、肝脏、脑、脾脏、肾脏和鳃中表达,并且在脂肪组织的表达量显著高于其他组织(P0.05)。发育表达分析结果显示,较小体质量试验鱼(50g)的A-FABP基因表达水平显著高于较大体质量试验鱼(120~130g和500g)(P0.05),并且其表达与背最长肌的肌内脂肪质量分数呈显著负相关。     

绵羊肺炎支原体热休克蛋白Hsp70 C末端基因原核表达

为研究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)热休克蛋白Hsp70抗原特性,以Mo贵州分离株为模板扩增得到Hsp70蛋白C末端基因,将目的基因连接至pET-28a原核表达载体,经PCR、双酶切和序列测定正确的阳性重组质粒转化E.coli Rosseta表达菌,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,经PCR从Mo贵州分离株扩增获得567bp的C末端片段,并成功构建含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达获得分子质量约为27ku的目的蛋白,且目的蛋白能与Mo阳性血清印迹反应。说明,成功构建可有效表达Mo贵州分离株Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体。     

绵羊肺炎支原体多表位融合基因MO-meAg1的构建、表达及重组蛋白免疫原性分析

为获得具有良好免疫原性的绵羊肺炎支原体(MO)重组蛋白,利用ABCpred等软件预测分析MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合基因MO-meAg1,合成后将其亚克隆至表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-32a(+)-MO-meAg1。将pET-32a(+)-MOmeAg1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDSPAGE结果显示,MO-meAg1重组蛋白分子质量约34.5ku;Western blot分析结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,重组蛋白MO-meAg1具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗血清其间接血凝效价可达1∶128以上。获得的多表位融合蛋白MO-meAg1为绵羊支原体肺炎的免疫学诊断及新型疫苗研究奠定基础。     

绵羊NICD基因的克隆、真核表达及其序列分析

采用RT-PCR技术扩增绵羊Notch基因胞内段功能结构域(NICD),将其克隆到慢病毒表达载体中,在293T细胞中对其进行真核表达,通过Western blotting鉴定其蛋白表达,进一步对NICD核酸和氨基酸序列进行分析。结果表明,首次克隆获得绵羊NICD基因,该基因序列为2 388bp(GenBank登录号为KF318190.1),编码795个氨基酸,重组蛋白分子质量为110ku左右。序列分析结果显示,核酸序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和83%,进化上与牛的关系最近;蛋白序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和84%,预测二级结构可能存在26个α-螺旋、13个β-折叠、66个转角和64个无规则卷曲。     

绵羊TGFβ2基因及其剪切体的克隆与生物信息学分析

旨在克隆绵羊TGFβ2(Transforming growth factor-β2)基因CDS,解析其序列及编码蛋白的生物学特性,为绵羊生产利用提供理论基础。采用PCR技术克隆获得TGFβ2基因的CDS,并进行生物信息学分析。结果表明:绵羊TGFβ2基因的CDS长度为1 329bp,编码442个氨基酸;其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2由于CDS部分缺失分别编码331和414个氨基酸。绵羊TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2编码蛋白的理论等电点分别为8.74、7.60和8.82,均存在1个信号肽和1个跨膜结构域,由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成;序列同源性分析发现,绵羊TGFβ2基因编码区的核苷酸和氨基酸序列与其他哺乳动物同源性较高,进化树分析表明,绵羊TGFβ2氨基酸序列与人类的进化关系较近,与斑马鱼较远;细胞定位分析表明TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2主要在细胞外基质中发挥作用,调控下游靶基因的表达。获得绵羊TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2完整的CDS,与TGFβ2转录本相比,TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2分别缺失111和28个氨基酸序列,其可能通过与TGFβ2转录本不同的分子调控机制发挥重要的生物学作用。     

绵羊EDAR基因的克隆、序列分析及其在毛囊发育过程中的表达

旨在获得中国美利奴羊EDAR(ectodysplasin A receptor)基因的CDS区全序列并进行生物信息学分析,同时分析EDAR在绵羊毛囊发育过程中的表达特性,为深入研究该基因在绵羊毛囊生长发育过程中的作用及其表达调控提供基础资料。采用PCR扩增获得绵羊EDAR基因全长编码区,并克隆到PCRTM-BluntⅡ-TOPO@vector进行测序;利用生物信息学方法预测蛋白结构;应用qRT-PCR技术检测EDAR基因在绵羊毛囊发育过程中的表达特征。结果表明,绵羊EDAR基因的CDS序列长度为1 350bp(GenBank登录号:KX900497),编码449个氨基酸,该氨基酸序列与其他物种相比一致性较高;进化树分析表明,绵羊EDAR氨基酸序列与牛的进化关系较近,与斑马鱼较远;预测结果显示绵羊EDAR蛋白存在一个信号肽和一个跨膜结构域;qRT-PCR分析表明,EDAR基因在绵羊胎儿毛囊发育过程中均有表达,在毛囊发育第55天和第135天表达较高,第75天表达最低。获得绵羊EDAR基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特性,生物信息学分析发现EDAR基因的编码区序列具有物种间的保守性,同时该基因在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达,由此表明EDAR基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要作用。     

绵羊肺炎支原体Y-98株外膜蛋白成分分析及其免疫原性研究

采用TritonX-100裂解和0．6％KI提取的方法制备绵羊肺炎支原体Y-98株外膜蛋白，经12％SDS-PAGE分析，表明其分子量范围在14．4—125．9KD之间；分别制备抗Y-98株全细胞抗原和外膜蛋白高免血清，经Western-blotting分析，表明外膜蛋白为绵羊肺炎支原体的主要保护性抗原，而在外膜蛋白，67．6、39．3和28．8KD多肽为其主要保护性抗原。利用间接ELISA方法和MTT法对外膜蛋白引起的体液免疫和细胞免疫功能进行了测定，结果表明膜蛋白能够诱导机体产生高效价的抗体，免疫后7、14和28d效价分别达到了1：2^4.25、1：2^7.75和1：2^8.75;膜蛋白具有非特异性和特异性致有丝分裂作用，在免疫前0d及免疫后28d对T淋巴细胞刺激的转化率分别为8．46％和18．3％。     

盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响

为研究盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响,首先分离试验羊的淋巴细胞,分别将盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白和绵羊肺炎支原体加入体外培养的淋巴细胞中共同孵育,利用real-time PCR技术检测肺炎支原体16SrRNA的表达水平。结果表明,体外淋巴细胞与绵羊肺炎支原体、重组ISG15蛋白共培养12h到96h,盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平显著低于对照组(P0.05),而杂交羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平与对照组差异不显著(P0.05)。说明盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白在体外可对绵羊肺炎支原体起到抑制作用。     

绵羊肺炎支原体 p113 基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.     

小麦TaSPL17基因的克隆、组织特异性表达及原核表达分析

具有SBP结构域的SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用。为了进一步研究小麦基因TaSPL17的功能,本研究通过同源克隆的方法,从普通小麦品种‘小偃22’中克隆得到TaSPL17基因全长CDS序列。生物信息学分析表明,该基因开放阅读框长度1 158bp,编码385个氨基酸,理论分子质量40.25ku,理论等电点为9.12。半定量RT-PCR结果显示,TaSPL17在小麦根、茎基部、叶片、幼穗中均有表达,在幼穗和茎基部中表达量最高,根次之,在叶片中表达量最少,表明TaSPL17基因可能与小麦的分蘖和穗部的发育有关。将基因TaSPL17与载体pGEX6P-1连接构建原核重组表达载体pGEX6P-1-TaSPL17,然后将其转入大肠杆菌DH5α并对诱导表达的时间、IPTG浓度、温度进行优化,SDS-PAGE分析表明,融合GST标签的TaSPL17在温度37℃,IPTG浓度为0.4mmol/L,诱导3h后表达量最大,有助于进一步纯化TaSPL17蛋白质。     

致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05 Pfs基因的克隆、功能序列分析及原核表达

采用PCR技术从致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05基因组中扩增得到甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)基因的全序列,对其功能序列进行分析,同时与其他细菌相应序列及编码的氨基酸进行同源性分析,构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行反应原性分析。结果显示:XJ05的Pfs基因全长696bp,与XJ01、XJ08、XJ11,与屎肠球菌TX 2466之间的同源性在99.1%以上,其中,XJ05与V583为100%,且关键的功能序列相同,与肺炎链球菌同源性在55.8%以上、霍乱弧菌同源性在55.0%以上;pfs基因编码231个氨基酸,XJ05、XJ01、XJ08、XJ11与肺炎链球菌、霍乱弧菌、粪肠球菌V583、屎肠球菌TX 2466的同源性在86.43%以上;构建的重组质粒经诱导后表达蛋白分子量为28ku,Western blot检测显示特异性条带。结果表明,表达的融合蛋白具有良好的反应原性。     

IMPDH基因克隆、生物信息学分析及在牦牛卵巢不同时期中的差异表达

旨在获得牦牛IMPDH基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其在卵巢组织中的时序表达谱,为进一步研究卵巢生长发育及排卵机制奠定基础。通过RT-PCR技术克隆牦牛的IMPDH基因,并运用生物信息学方法分析不同物种序列进化关系,利用荧光定量qRT-PCR技术检测IMPDH基因在不同发育时期牦牛卵巢组织中的表达情况。结果显示,克隆得到牦牛1 623bp的IMPDH基因cDNA序列,内含1 545bp开放阅读框序列,编码514个氨基酸残基。与野牦牛的相应序列具有很高的同源性(99.4%),表明IMPDH基因在进化过程中相对保守。实时定量RT-PCR检测结果显示IMPDH基因的表达随年龄的增加而呈现上升趋势。荧光定量qRT-PCR检测结果显示IMPDH基因在卵巢卵泡期表达最强,显著高于红体形成期。结果表明IMPDH参与牦牛卵巢组织的生长发育,并在卵巢活动中有明显的表达规律,表明IMPDH基因在牦牛繁殖周期具有重要作用,为进一步研究牦牛IMPDH基因功能奠定基础。