山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、 序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。     

布氏杆菌Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA的克隆、原核表达及免疫原性分析

为克隆并原核表达布氏杆菌(Brucella melitensis)疫苗菌株M5Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA,并进行表达蛋白的免疫原性分析,应用PCR技术从布氏杆菌疫苗菌株M5全基因组扩增RicA基因片段,亚克隆至pMD18-T载体后测序分析,构建重组表达载体pET-28a(+)-RicA,转化E.coli BL21(DE3)表达菌,以不同浓度IPTG诱导表达不同时间,SDS-PAGE鉴定表达效果,表达蛋白经AKTA蛋白纯化系统纯化,用Antheprot 5.0软件分析其理化特性及抗原性,Western Blot检测其免疫原性。结果表明:RicA基因全长528bp,编码175个氨基酸,与基因库中已知菌株的核苷酸同源性和氨基酸同源性均达到99%以上。SDS-PAGE表明,RicA融合蛋白在大约23ku处出现条带,纯化后条带单一。软件分析发现RicA蛋白融合抗原性较强,Western Blot检测证明其有较好的免疫原性。说明,成功克隆并表达布氏杆菌疫苗菌株M5 RicA基因,为进一步研究其与布氏杆菌Ⅳ型分泌系统及布氏杆菌致病机制之间的关系奠定了基础。     

绵羊肺炎支原体HSP70基因的克隆、表达及免疫原性分析

根据GenBank登录的MO HSP70基因序列,设计特异性引物对MO新疆分离株HSP70基因进行扩增,克隆入T载体中测序。将HSP70基因亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX4T-1-HSP70,并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为53ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组HSP70具有良好的反应原性。重组HSP70蛋白免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

猪TGEV HN-2012株ORF3a和ORF3b基因遗传变异分析及其真核表达研究

【目的】研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒ORF3a和ORF3b基因序列,分别设计合成1对特异性引物,通过RTPCR从猪传染性胃肠炎病毒HN-2012株的cDNA中扩增ORF3a和ORF3b基因,经克隆测序后,将其基因序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析,然后将ORF3a和ORF3b基因亚克隆至真核表达载体,构建pCAGGS-ORF3a-flag和pCAGGS-ORF3b-flag载体,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体对2个基因的蛋白表达情况进行Western blot分析。【结果】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与其他毒株间核苷酸的同源性为92.6%~100%,ORF3b基因与其他毒株间核苷酸的同源性为98.6%~99.7%。Western blot结果表明,ORF3a蛋白和ORF3b蛋白的分子质量约为8ku和28ku。【结论】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与CH/JLY2/08、CH/HLJH/08株等亲缘关系较近,ORF3b基因与TS株、Miller M6株等亲缘关系较近,与我国其他毒株关系较远;成功实现了ORF3a和ORF3b蛋白在293T细胞中的表达。     

绵羊肺炎支原体延伸因子EF-P基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫原性研究

为筛选绵羊肺炎支原体(MO)免疫相关蛋白,以MO新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增其EF-P基因,测序后对其编码蛋白进行分子特征分析;用生物信息学软件预测其抗原表位集中区编码片段;进一步将该基因片段克隆入pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-EF-P,将pET-32a(+)-EF-P质粒转化至感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达后,检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDS-PAGE结果显示,EF-P重组蛋白分子质量为29.5ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体,采用正向间接血凝方法检测效价可达1∶64,提示其具有较强的免疫原性。     

中国新疆小反刍兽疫病毒F基因序列分析

为分析中国新疆小反刍兽疫病毒(PPRV)毒株分子演变特点和疫情传播路线,从GenBank数据库下载所有国家全部的PPRVF基因全序列,应用DNAStar软件,结合疫情毒株时空分布进行序列分析。结果显示,中国新疆PPRV株F基因全序列,与2014年小反刍兽疫情中河南和北京毒株核苷酸的同源性最高,为99.8%~99.9%,与中国西藏3个毒株核苷酸的同源性为97.7%,与中国采用的疫苗株核苷酸同源性为92.9%,核苷酸同源性最低的是肯尼亚毒株,与国外毒株核苷酸同源性最高的是印度毒株。F基因系统进化关系分析显示,中国新疆PPRV株属于基因Ⅳ系。F蛋白氨基酸同源性结果显示,除与科特迪瓦1989年毒株ICV89氨基酸同源性最低外,与其他氨基酸同源性比对结果均与核苷酸的比对结果一致。中国新疆PPRV株存在一定程度的变异,可能是由周边国家传入。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05 Pfs基因的克隆、功能序列分析及原核表达

采用PCR技术从致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05基因组中扩增得到甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)基因的全序列,对其功能序列进行分析,同时与其他细菌相应序列及编码的氨基酸进行同源性分析,构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行反应原性分析。结果显示:XJ05的Pfs基因全长696bp,与XJ01、XJ08、XJ11,与屎肠球菌TX 2466之间的同源性在99.1%以上,其中,XJ05与V583为100%,且关键的功能序列相同,与肺炎链球菌同源性在55.8%以上、霍乱弧菌同源性在55.0%以上;pfs基因编码231个氨基酸,XJ05、XJ01、XJ08、XJ11与肺炎链球菌、霍乱弧菌、粪肠球菌V583、屎肠球菌TX 2466的同源性在86.43%以上;构建的重组质粒经诱导后表达蛋白分子量为28ku,Western blot检测显示特异性条带。结果表明,表达的融合蛋白具有良好的反应原性。     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

墨兰FT同源基因的时空表达及功能分析

FLOWERING LOCUS T(FT)基因是植物开花调控途径的整合基因,整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号,在植物花发育中发挥着重要作用。从墨兰品种‘企剑黑墨’中克隆了新的FT同源基因,并对其各组织部位的表达特性和生物学功能进行了分析。结果表明,墨兰FT基因c DNA全长序列为618bp,其中开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、水稻中FT基因的氨基酸序列有较高的同源性。墨兰FT同源基因在‘企剑黑墨’各器官中均有表达,营养生长期FT基因在腋芽中的表达量最高,生殖生长期FT基因在腋芽,花梗,花蕾等器官中的表达量较高,在根和叶中的表达量最低。在拟南芥中超表达墨兰FT同源基因,能显著促进拟南芥开花。     

甜玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能分析

【目的】鉴定玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能标记在47份甜玉米骨干自交系中的多态性和对类胡萝卜素各组分含量的影响,为了解玉米类胡萝卜素合成关键基因的功能及维生素A源强化育种提供参考和依据.【方法】以47份甜玉米骨干自交系为材料,用高效液相色谱法检测籽粒乳熟期类胡萝卜素各组分的含量,合成基因PSY1、LCYE和CrtRB1的6个功能标记并在47份甜玉米自交系中检测其基因型,结合基因型和类胡萝卜素各组分的含量,检测3个关键基因的单倍型效应,并分析联合单倍型效应.【结果和结论】除CrtRB1基因的标记Indel4未检出多态性,其余标记均检测出多态性.PSY1的Indel1和Indel4组成的单倍型可解释玉米黄质和总类胡萝卜素含量表型变异的14.81%和13.00%,LCYE的5'Indel和3'Indel位点分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的15.77%、20.75%和15.92%,CrtRB1的标记3'TE未检测出显著性.基因PSY1、LCYE和CrtRB1组成的联合单倍型分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的37.20%、40.71%和41.11%.基因间联合单倍型效应高于单基因单倍型效应.PSY1和LCYE有利等位基因对甜玉米中类胡萝卜素的合成有重要影响,其功能标记可用于分子标记辅助选择,为甜玉米的维生素A源强化育种奠定了基础.     

优质肉鸡VIP和DRD基因多态性与性成熟的关联分析

为探究鸡血管活性肠肽受体基因(VIP1和VIP2)和多巴胺受体基因(DRD1)多态性与性成熟的关系,采用PCR-SSCP和SNPs测序验证等方法对优质肉鸡F系287个个体进行了性成熟相关性状的关联分析。结果表明,VIP1基因处发现2个突变位点,分别为73352处C→T的突变,68818处T→C的突变;VIP2基因发现1个突变为36 127处A→G的突变。DRD1基因发现3个突变位点,分别为201处C→T的突变,208处A→G的突变及255处A→G的突变。与性成熟的关联性分析表明,VIP1基因73 352处的基因突变与冠高、冠长、冠重和睾丸重显著相关(P0.05),而与生长激素GH、睾酮激素TEST差异不相关(P0.05);VIP2和DRD1各处基因突变与性成熟相关指标均存在不同程度的差异显著(P0.05),但都与生长激素GH和睾酮激素TEST差异不相关(P0.05)。结果提示说明,VIP1、VIP2和DRD1基因可作为性成熟性状标记辅助选择的有效分子标记。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

海岛棉GbHCT14基因启动子克隆及上游调控因子筛选

为探究GbHCT14基因CDS区及启动子序列在棉花纤维发育中的作用,通过中国农业科学院棉花研究所数据库检索到GbHCT14基因CDS区及上游非编码区-2 000 bp片段序列,克隆CDS区及启动子,并检测启动子活性。构建cDNA文库,利用酵母单杂交技术筛选阳性克隆,获得候选转录因子,并进行生物信息学分析。结果表明:1)GbHCT14基因的CDS区全长1 144 bp,其翻译产物为亲水性稳定蛋白,预测定位在叶绿体,没有信号肽以及跨膜结构域。2)GbHCT14基因启动子预测到5个MYB结合位点参与植物苯丙烷代谢途径的调节,1个TCA-element参与水杨酸调节,6个ABA响应元件。3)GbHCT14启动子能够驱动GUS蛋白表达,具有启动活性。4)酵母单杂交初步筛选出16个候选基因,包括Gbar_D01G020710、Gbar_A09G017360、Gbar_A09G009680、Gbar_A11G003660、Gbar_A12G004430、Gbar_D04G021210、GbM_D09G1212、GbM_A11G0186、GbM_A03G0171、GbM_A09G1247、GbM_D10G0411、GbM_D10G1024、GbM_D02G1379、GbM_A11G1190、GbM_D12G0471和genome_Gbar-ZJU_D08。利用生物信息学分析预测表明,上述候选基因参与棉花纤维细胞壁的伸长、泛素化反应、细胞分裂、花发育以及果实成熟的过程,其中GbM_A09G1247与WAK2为相似基因,WAK2功能蛋白与果胶结合后促进细胞壁的伸长,而HCT家族基因则是影响果胶合成的关键因素之一。5)GbHCT14和WAK2基因在棉花开花后25 d内高表达,两者在棉花纤维发育调控存在相关性。综上,GbHCT14基因CDS区及启动子序列为首次获得,GbHCT14基因启动子具有启动活性,并且筛选到与裂合酶、转移酶、植物激素、质子泵和功能蛋白相关的16个上游调控的候选转录因子。     

甘薯抗草甘膦生理指标及其相关基因EPSPS和AKR的表达

【目的】研究草甘膦胁迫下甘薯生理指标以及EPSPS和AKR 2个基因相对表达水平的变化,探讨甘薯耐草甘膦的分子机制。【方法】选取对草甘膦敏感性不同的2个甘薯品种N3589(草甘膦敏感型品种)和鄂薯11(草甘膦抗性品种)为试验材料,以喷施清水为对照,研究喷施草甘膦后甘薯莽草酸和脯氨酸含量及根系活力的变化,以及EPSPS和AKR基因的表达情况。【结果】与喷施清水对照相比,喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589叶片的莽草酸含量显著升高,草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的莽草酸含量升高不显著;2个品种甘薯块根和叶片的脯氨酸含量均显著升高;植株的根系活力均显著降低。q-PCR结果显示,在喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589的EPSPS基因显著下调,AKR基因先上调表达后下调表达;而草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的EPSPS基因显著上调,AKR基因先下调表达后上调表达。【结论】甘薯耐草甘膦主要是因为喷施草甘膦之后,EPSPS基因迅速上调表达,从而减少体内莽草酸累积对植株造成的伤害;与此同时,喷施草甘膦后AKR基因迅速上调表达,参与了甘薯体内草甘膦的代谢。     

山荆子MbLRK10L1.1基因正调控腐烂病抗性

此前从东北山荆子（Malus baccata）中发现可能参与腐烂病信号响应的WAK基因 MbLRK10L1.1，在此基础上，拟结合生物信息学分析、表达分析和功能验证研究其在腐烂病抗性中的作用机制。结果表明， MbLRK10L1.1响应Valsa mali（Vm)信号，并且在瞬时表达MbLRK10L1.1后，‘烟富6号’果实表面病斑扩散速率明显减小， FRK1（Flg22-induced Receptor-like Kinase 1）、TaNOX（Triticum aestivum NADPH oxidase）、 EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）等相关抗病基因均有不同程度的上调表达。表明 MbLRK10L1.1可通过JA、SA、SAR以及PTI等途径正调控果实对腐烂病菌的抗性。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.