板栗Hsp90基因家族的鉴定及在胚珠发育过程中的表达分析

  目的  热激蛋白（Hsp90）是一种在细菌、植物、动物中均广泛存在的高度保守的蛋白质分子,在植物应激反应和生长发育等过程中发挥着重要的作用。板栗作为我国重要的坚果树种,雌雄花比例不同、授粉受精困难及胚败育等现象致使板栗单产低,严重制约板栗的产量。近期有研究发现Hsp90基因家族参与植物的胚形成,本研究首次对板栗中Hsp90基因家族进行鉴定及表达分析,旨在揭示Hsp90基因家族的功能及其在授粉受精和胚珠发育过程中的作用,进而为提高板栗产量提供理论依据。  方法  利用生物信息学方法对板栗Hsp90基因家族成员进行了鉴定,分析家族成员的理化性质、基因结构、进化关系、启动子元件。基于转录组数据分析CmHsp90基因在板栗胚珠不同发育时期的表达情况。  结果  本研究在板栗中共鉴定到10个CmHsp90基因,该基因家族成员的编码区（CDS）长度范围是2 112 ~ 2 481 bp,含有4 ~ 22个外显子,编码703 ~ 826个氨基酸,相对分子量范围为80.67 ~ 94.21 kDa,等电点pI范围介于4.81 ~ 5.26;不稳定系数介于36.15 ~ 46.75之间,除CmHsp90-6、CmHsp90-4、CmHsp90-9外,其他基因编码的蛋白质相对比较稳定。对CmHsp90基因家族蛋白进行亚细胞定位预测发现:5个成员（CmHsp90-1、CmHsp90-4、CmHsp90-5、CmHsp90-9、CmHsp90-10）定位到了细胞质上,2个成员（CmHsp90-7、CmHsp90-8）定位到了内质网上,其余3个成员分别定位到细胞核（CmHsp90-3）、线粒体（CmHsp90-2）和叶绿体上（CmHsp90-6）上。对CmHsp90基因家族蛋白信号肽预测发现,仅CmHsp90-7和CmHsp90-8存在潜在的信号肽位点。CmHsp90基因家族蛋白的motif、保守结构域基本一致,均包含Hsp90结构域（PF00183）和HATPase_C结构域（PF02518）。基于系统进化树分析,10个CmHsp90家族蛋白被分为5个组。对CmHsp90基因家族启动子区域进行顺式作用元件预测,发现光响应元件是CmHsp90基因家族启动子上的主要调控元件,其次为ABA响应元件,此外,有4个基因（CmHsp90-1、CmHsp90-5、CmHsp90-7、CmHsp90-8）存在温度响应元件。通过对板栗胚珠不同发育阶段的RNA-seq数据进行分析发现:除CmHsp90-3基因外,其他基因在受精前胚珠中的表达量均高于受精后胚珠;CmHsp90-2、CmHsp90-4、CmHsp90-5、CmHsp90-7、CmHsp90-8、CmHsp90-9、CmHsp90-10基因在发育胚珠中的表达量高于败育胚珠。  结论  CmHsp90基因在胚珠不同发育过程中的表达存在差异,在同一子房内发育胚珠和败育胚珠中的表达情况也不尽相同,研究结果为下一步研究CmHsp90基因在板栗授粉受精以及胚发育过程中的具体作用奠定理论基础。      

葡萄胚珠发育及败育过程中果实主要营养成分变化

[目的]探明无核葡萄胚挽救的最佳培养条件。[方法]以无核品种无核白鸡心和有核品种维多利亚为试材,研究葡萄胚珠发育及败育过程中果实主要营养成分含量的变化。[结果]有核品种果实内可溶性糖、K、Mg含量高于无核品种,而Mn、Fe含量则相反,无核品种的含量高于有核品种。[结论]该研究为提高无核葡萄胚挽救成功率提供理论依据。     

无核葡萄胚珠发育过程中内源激素及多胺含量的变化

【目的】探究无核葡萄胚珠发育过程中内源激素和多胺含量变化对胚发育的影响,为花前喷洒外源激素及胚珠离体培养条件下培养基中添加外源激素以促进胚的发育提供理论依据。【方法】以欧亚种葡萄(Vitis vinifera L.)有核品种‘京秀’及其F₁代种子败育型无核品种‘秦秀’为材料,采用高效液相色谱质谱(high performance liquid chromatography mass spectrometry,HPLCMS)和超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)分析方法,比较二者在果实不同发育时期胚珠中内源激素和多胺含量的变化规律。【结果】对于生长素(IAA)、玉米素(ZT)、玉米素核苷(ZR)和N6-异戊烯腺嘌呤(i PAS)含量,‘京秀’在花后39 d达到最高值,‘秦秀’在花后42 d达到最高值,但前者最高值均高于后者(1.5倍以上);对于茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)含量,‘京秀’在花后36 d(2 000 ng·g^-1和6 500 ng·g^-1)...     

黑羽番鸭LPL基因克隆及在肌肉发育中的表达规律

脂蛋白脂酶(LPL)是水解甘油三酯的关键性酶,可以为细胞提供游离的甘油三酯,并作用于脂蛋白循环,与机体的脂质代谢有密切关系。本研究利用同源克隆策略克隆黑羽番鸭LPL基因,并采用实时荧光定量PCR技术分析其在肌肉组织发育过程中mRNA表达规律。结果表明,黑羽番鸭LPL基因cDNA序列长度为1515 bp,包括了1485 bp的编码区,编码494个氨基酸。与禽类LPL基因核苷酸和氨基酸序列同源性均在90%以上,与人和哺乳动物同源性在70%~75%之间。实时荧光定量PCR检测结果显示,LPL基因在第2周龄胸肌中mRNA表达量较低,然后开始上升,达到最大值再出现下降并保持在一定水平上;公鸭腿肌表达规律和公鸭一致,但是母鸭腿肌表达量呈波浪状。     

花生AhbZIP4基因克隆及其在侧枝发育中的表达分析

花生侧枝发育决定株型的建成,但有关花生侧枝发育的基因尚知之甚少。为探究AhbZIP4基因序列特征及在2种株型花生品种的组织器官中的表达模式,本研究从侧枝直立型花生‘冀花5号’（JH5）中克隆获得AhbZIP4基因（Arahy.CS824N.1）序列,并对其进行序列特征分析、亚细胞定位和不同株型品种组织器官表达分析。序列分析表明,该基因编码序列全长1 182 bp,编码393个氨基酸,预测蛋白质分子质量为42.10 kD,蛋白质二、三级结构具典型的bZIP拉链,无跨膜域和信号肽;系统进化分析发现,AhbZIP4与大豆GBF2和GBF2A同源性最高;亚细胞定位显示,AhbZIP4位于细胞核和细胞膜中;表达量分析说明,JH5和匍匐型花生M130除在结荚期时的花中表达差异不显著,在其他生育期的不同组织中均呈现显著或极显著表达差异。其中,2个品种在侧枝发育的15～25 d之间,AhbZIP4表达差异极显著,推测该基因可能间接影响花生株型的分化。研究结果将为进一步揭示花生侧枝发育及株型建成的分子机制提供理论基础。     

VvmiR396及其靶基因VvGRF1在葡萄种子发育过程中的表达分析

[目的]本文旨在鉴定葡萄miR396家族成员(VvmiR396)及其靶基因VvGRF1,探究VvmiR396-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396及其靶基因,利用生物信息学分析其潜在功能与进化保守性,利用RT-qPCR方法检测VvmiR396在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396-VvGRF1相关性差异。[结果]与葡萄品种‘魏可’相比,‘京可晶’花后28 d时种子发育被严重抑制,出现败育且种子萎缩,而‘魏可’种子正常发育。对VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c、VvmiR396d的前体及其成熟体序列进行鉴定,其前体均可形成典型的茎环结构,成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近,而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396的8条潜在靶基因,利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1和VvGRF10是VvmiR396的真实靶基因,且VvmiR396对VvGRF1的裂解位...     

番鸭IGF-I基因克隆及其在肌肉组织发育中的表达规律

IGF-I基因在动物肌肉生长过程中起着重要的作用。本试验采用克隆、测序方法获得番鸭IGF-I基因碱基序列,使用生物信息学软件进行序列分析,同时采用实时定量PCR方法分析肌肉发育过程中IGF-I基因的mRNA表达规律。获得了番鸭IGF-I基因563 bp的c DNA序列,包括462 bp的编码区,编码153个氨基酸,与禽类IGF-I基因碱基序列及其编码的氨基酸序列同源性均在98.1%以上,与人和哺乳动物同源性为76.8%~83.7%。实时荧光定量PCR检测结果显示,在肌肉组织中IGF-I基因m RNA的表达量均表现为第2周龄最高,然后下降,在第4周龄时达到低点,再上升,最后除母鸡腿肌外,其他再次下降,不同性别、不同组织之间下降的周龄有差异。     

黄鳝WT1基因序列分析及在性腺发育过程中的表达

采用RT-PCR法从黄鳝(Monopterus albus)性腺mRNA中克隆获得了WT1基因,根据其氨基酸序列有无KTS区将黄鳝WT1基因分为2种类型:WT1(-KTS)为1 236bp,WT1(+KTS)为1 245bp。与NCBI/GenBank上其他物种进行氨基酸序列比对,发现它们与斜带石斑鱼的WT1a相似性最高,分别为93.2%和93.0%,并且它们均在羧基端具有相似性很高的锌指结构区域。系统进化树分析发现,黄鳝WT1基因与斜带石斑鱼WT1a聚类为一支。WT1基因在黄鳝性腺、肾、肠、脾和心脏组织中都有表达,且该基因在黄鳝雌性、间性和雄性性腺中的表达量在各时期都有先升高后降低的表达趋势。     

无核葡萄胚珠发育及早期离体培养的研究 Ⅱ.无核葡萄胚发育的特点

对8个假单性结实类型(种子败育型)无核葡萄品种的胚发育进行的解剖和切片检查表明,种子败育型品种合子胚的发育与有核品种基本相似,但合子胚形成的能力、胚败育时发育的程度以及浆果成熟时胚珠及胚残留的程度均存在很大差异,同一品种胚的发育和败育都不是同步的。     

巴西橡胶树HbUBC5基因克隆、生物信息学及表达分析

为研究巴西橡胶树泛素结合酶(UBC)基因功能,采用PCR技术从巴西橡胶树中克隆了一个UBC基因,用半定量RTPCR分析基因表达模式,同时对基因编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,基因长681 bp,最长开放阅读框555 bp,预测编码蛋白包含184个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC5(At1g63800)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC5。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC5在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在树皮中表达最低。HbUBC5在叶片不同发育时期表达模式存在变化,在古铜期最低,在稳定期最高。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC5表达量明显下降。HbUBC5表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC5可能在巴西橡胶树死皮、产排胶、乙烯和茉莉酸反应中发挥作用。     

陆地棉胚珠及纤维发育过程中miRNA分离与鉴定

microRNA(miRNA)是生物中一类起负调控作用的非编码的小分子RNA,主要在转录后水平上调节生物体的生长与发育。直接克隆法是鉴定植物中miRNA最常用也是最有效的方法之一。利用直接克隆法分离了陆地棉开花后0~10 d(days post anthesis, DPA)胚珠中总RNA,从中筛选17~24 nt小分子RNA构建cDNA文库,对初筛得到的阳性克隆进行测序。通过与miRNA数据库比对,最终获得4个保守的miRNA。进一步对他们的转录表达进行分析,发现所有miRNA在棉花胚珠纤维不同发育时期均能表达。其中miR167a、miR172c和miR394b在棉花幼苗的根茎叶中有不同程度的表达。预测得到55个miRNA的靶基因,多数靶基因编码转录因子、代谢酶类以及发育相关蛋白,进一步证明miRNA参与调控棉花纤维的形态建成、发育等各项生理活动。     

葡萄风信子黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

以葡萄风信子‘亚美尼亚’的根、茎、叶、花为材料,采用RT-PCR技术克隆得到一条FLS基因,命名为MaFLS2。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长为1 152 bp,含有完整的开放读码框1 056 bp,编码353个氨基酸,MaFLS2蛋白是一种亲水性蛋白,氨基酸序列含有典型的DIOX_N结构域(2-酮戊二酸-双加氧酶活性的N端区域)和2OG-FeII_Oxy超家族结构域,属于2-酮戊二酸-双加氧酶(2-ODDs)蛋白家族。实时定量PCR结果显示,MaFLS2基因在蓝白葡萄风信子中的表达存在组织特异性,蓝色品种‘亚美尼亚’中在花蕾未着色时表达量最高,而白色品种‘白丽人’在根中表达量最高, 在花发育的不同阶段,MaFLS2基因在‘亚美尼亚’中的表达峰值出现在花蕾未着色时期,基因表达总体呈现出先降低后升高再降低的趋势,而在‘白丽人’中的表达峰值出现在转色中期,总体呈现出先升后降的趋势。研究结果为开展单子叶植物花色育种提供了理论依据。     

无核葡萄离体胚珠发育影响因子及其生理变化

【目的】研究无核葡萄离体胚珠发育影响因素,为提高无核葡萄胚挽救育种效率提供技术参考。【方法】选择‘红宝石’无核葡萄为材料,在自然授粉后65 d摘取葡萄幼果,消毒处理后,剥取胚珠接种到不同培养基上。研究不同培养基处理(4种不同的基本培养基、附加4种不同蔗糖含量,共计16个处理)和不同培养时间对胚珠发育率和生理指标的影响,并对胚珠发育率和不同生理指标进行相关分析。【结果】在胚珠离体培养阶段,不同处理对胚珠发育率影响不同。采用固液双层基本培养基(改良MM3固体培养基+8 mg·L-1 ER液体培养基)、附加45 g·L-1蔗糖、培养49 d时,胚珠发育率最高,达到(42.23±6.93)%。不同处理对离体培养胚珠各生理指标影响不同。当培养时间相同、基本培养基为固液双层培养基时,胚珠淀粉含量变化差异不显著,而可溶性蛋白含量、总酚含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性均增加,过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性均降低;随着附加蔗糖含量的增加,胚珠淀粉含量变化差异不显著,而可溶性蛋白、总酚含量和SOD酶活性均出现先增加后下降的趋势,POD酶和PPO酶活性均出现逐渐升高的趋势。当培养基处理相同...     

刺葡萄DFR基因克隆及生物信息学分析

根据葡萄DFR基因CDS序列设计刺葡萄开放阅读框(ORF)特异引物,利用RT-PCR技术克隆获得其DFR基因序列,并通过生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明,刺葡萄DFR基因ORF序列全长1 014bp,编码337个氨基酸,命名为Vitis davidii dihydroflavonol 4-reductase gene(VdDFR),GenBank登录号为KF915803。刺葡萄DFR蛋白预测分子量为37 593.2Da,理论等电点pI为5.81,是一个跨膜亲水蛋白,无典型信号肽,不属于分泌蛋白,并且亚细胞定位主要位于细胞质中(70%);二级结构以无规则卷曲为主(52.82%),是一种mixed类蛋白;该蛋白有潜在的7个糖基化位点和16个磷酸化位点,具有NAD(P)结合位点,有NAD依赖型的表异构酶/脱氢酶的N端结构域,属于NADB_Rossmann超家族成员。核苷酸序列分析表明,刺葡萄DFR基因与美丽葡萄、山葡萄和酿酒葡萄的同源性为99%,与圆叶葡萄同源性为98%,与显齿蛇葡萄同源性为94%,进化上比较保守,利用DFR基因编码区碱基序列所建立的系统关系树与真实的植物进化基本一致。     

葡萄花芽发育相关基因在不同节位芽中的表达分析

【目的】通过对‘藤稔’葡萄花发育相关基因及物候期的研究,揭示葡萄枝蔓上不同节位芽发育早晚与快慢的机理。【方法】以8年生‘藤稔’葡萄（Fujiminori）为试材,选取生长势基本均匀、粗度基本一致（枝条粗度约为1.15cm）,节数约为35节的一年生枝条,采用实时荧光定量PCR技术对8个花发育相关基因（VvFT、VvSOC1、VvAP1、VvAP2、VvAP3、VvFUL、VvAG和VvFLC）在不同节位芽中的时空表达特性进行研究。并对其花芽分化的物候期进行观察统计。【结果】‘藤稔’葡萄花芽超节位分化的特点明显。高节位上的花芽分化由底部向上部逐渐进行,上部花芽分化的时间明显短于底部先分化的芽。第一个芽从4月下旬或5月初开始形成和发育,顶部最后一个芽的形成时间是九月中下旬。从发育时间长短看,先分化的花芽生长发育时间比最后发育的多5个月。虽然不同节位芽的生长发育时间相差很大,但是其翌年都能发育成花器官,且花期时间基本一致。不同节位芽发育相关基因表达水平有所不同。不同节位芽中VvFT的表达水平都较低且在一年的生长季节内的变化不大;VvSOC1在各个生长时期不同节位芽中都有很高的表达,并且基本都呈现较一致的变化趋势。下部节位和上部节位芽中VvAP1、VvAP2、VvAP3、VvFUL表达的变化波动很小,而在中部节位芽中的表达变化则较大,存在一个明显的先上升后降低的过程,且在中部节位芽（8、11、15节位）中的表达量要高于其他节位;VvAG的表达趋势与VvAP1、VvAP2、VvAP3、VvFUL的表达趋势不同,其表达量逐步降低,表达高峰主要集中在芽发育的早期。中部节位的芽分化时间长,分化速度慢,基因的表达水平高,下部和上部节位的芽分化时间短,分化速度快,基因表达水平低,但其能维持相对较长时间的表达,最终不同节位的芽发育渐趋一致。【结论】不同节位花芽分化基因相对表达水平以及相对高水平表达持续时间有所不同。同一枝蔓上,花发育相关基因在中部芽中的表达量高于上部芽和下部芽,这可能是导致葡萄不同节位芽发育质量存在差异的因素之一。     

金银花肌动蛋白基因LjActin的克隆及在花发育过程中的表达分析

本研究在药用植物金银花中克隆得到1条肌动蛋白(Actin)基因序列,命名为Lj Actin(Gen Bank登录号:KY114518)。序列分析表明其全长1536 bp,其中编码框1134 bp,编码377个氨基酸残基,理论分子量为41.7 k Da,理论等电点为5.31。序列比对结果表明金银花的Actin和其它植物的Actin在序列上高度保守。进化分析结果表明金银花的Actin与拟南芥的At ACT7和水稻的Os ACT2聚为一支。RT-PCR结果显示Lj Actin在金银花5个不同发育时期的花中表达稳定。     

百合LoXTH23基因克隆、生物信息学分析及在鳞茎休眠解除过程中的表达动态

【目的】研究西伯利亚百合(Lilium oriental ‘Siberia’)休眠解除过程中LoXTH23基因的作用。【方法】以西伯利亚百合鳞茎为试验材料,从前期转录组测序结果中筛选出1个休眠解除期差异显著的XTH家族基因,利用RT-PCR技术扩增该基因cDNA全长序列,命名为LoXTH23。采用生物信息学软件对LoXTH23基因结构、理化性质等进行分析;采用荧光定量PCR技术测定LoXTH23基因在鳞茎休眠解除过程中的相对表达量。【结果】LoXTH23基因开放阅读框全长858 bp,编码285个氨基酸,包含GH16结构域,属于XTH家族基因;编码的蛋白相对分子量约为3.19 ku,理论等电点为6.19,是存在跨膜结构域和信号肽的不稳定亲水蛋白;二级结构中以随机卷曲为主,存在30个磷酸化位点;荧光定量PCR结果显示：LoXTH23基因的表达量在鳞茎休眠完全解除10 d时最高。【结论】LoXTH23可能在百合鳞茎休眠解除调控进程中起重要作用。     

金银花肌动蛋白基因LjActin的克隆及在花发育过程中的表达分析

本研究在药用植物金银花中克隆得到1条肌动蛋白(Actin)基因序列,命名为Lj Actin(Gen Bank登录号:KY114518)。序列分析表明其全长1536 bp,其中编码框1134 bp,编码377个氨基酸残基,理论分子量为41.7 k Da,理论等电点为5.31。序列比对结果表明金银花的Actin和其它植物的Actin在序列上高度保守。进化分析结果表明金银花的Actin与拟南芥的At ACT7和水稻的Os ACT2聚为一支。RT-PCR结果显示Lj Actin在金银花5个不同发育时期的花中表达稳定。