疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究

以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径     

松材线虫检测技术研究进展

本文回顾了松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的各类检测鉴定方法,包括基本的形态学鉴定方法、常规的分子生物学检测方法、近年来兴起的LAMP与POCD-RPA检测方法、基于蛋白质的检测方法等,并对各种检测方法进行了评价。     

疫木切面上松材线虫抗原的免疫学检测方法

利用抗松材线虫血清建立在疫木切面上直接进行免疫组化染色检测松材线虫抗原的方法。ELISA和免疫斑点印迹的结果表明:该方法对松材线虫具有较好的特异性,可以检测出木材表面0·1μg的线虫抗原,显示了较好灵敏度。自然感染松材线虫的黑松疫木免疫组化的染色结果表明:该方法可以清晰地检出管胞处松材线虫蛋白抗原的存在。     

松材线虫分子检测技术研究进展

由于松材线虫病引起松树的毁灭性危害,松材线虫的准确、快速鉴定工作被认为是松材线虫病防控的最重要的环节之一。针对松材线虫形态鉴定存在的不足,一系列松材线虫分子检测技术如限制性片段长度多态性、随机扩增多态性、特异引物PCR、实时定量PCR、核酸杂交检测等技术相继被开发利用。其中实时定量PCR检测技术与SCAR标记检测技术具有检测时间短、检测准确性高。该两项技术已广泛应用于我国生产实践中。     

松材线虫分子生物学检测技术研究进展

概述松材线虫分子生物学检测技术的基础，介绍了DNA探针技术、基于PCR的检测技术和卫星DNA技术等分子生物学检测方法，并对PCR-RAPD、PCR-RFLP和PCR-SSCP技术进行了比较。     

松材线虫鉴定技术初探

松材线虫病,又称松树枯萎病,是由松材线虫感染松树并导致该树在极短时间内迅速死亡的一种森林生物灾害。此病主要危害松属植物,在河南省主要危害油松、华山松、白皮松、雪松和日本落叶松。松树一旦感病即很难治愈,最快的仅在40多天内即可枯死,因此又被称为松树的“癌症”。目前,世界上已有40多个国家和多个组织都将其列为检疫对象。对松材线虫的鉴定目前除了对感病松树进行外观和生物学判断以外,主要采用对疑似感病松树进行取样,然后对线虫进行分离,在显微镜下进行鉴定的方法进行。     

松材线虫SCAR标记与检测技术

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’),反向引物为M05R1(5’-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3’),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。     

应用特异引物组合检测松材线虫

采用特异引物组合对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测。结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条860 bp的清晰、明亮的条带,而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物。利用此特异引物组合构建了松材线虫检测试剂盒。采用本试剂盒可以在较短时间内对线虫进行鉴定。整个检测过程约需3 h,实现了对松材线虫的快速检测目标。检测结果便于判读,适合于生产上应用。     

快速分离镜检松材线虫技术

总结了贝尔曼漏斗法分离镜检松材线虫实践经验,通过调高分离起始水温、室内气温和减少镜检液量、改变热杀死方式等措施,将常规分离镜检线虫时间从12h以上缩短到约6h.     

松材线虫在我国的分布

松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner＆Buhrer,1934)Nickle,1970]引起的松树萎蔫病(Pine Wilt Disease)是一种毁灭性病害。松树感染此线虫后可很快死亡。作者在温室用松材线虫接种三年生黑松苗,35d后76％的松苗即枯死了。据记载,在日本由于松材线虫为害引起的木材年损失量最高可达240万m~3 。自1981年以来,在我国湖南、贵州、云南、浙江、江苏等省都有松树枯死现象。1982年首次在南京发现松材线虫危害。以后,病情逐年加剧,到1987年已累计病死松树60万株,成为我国突出的、至今尚无防治良策的一大森林病害。     

松材线虫的低温冷冻保存

研究-80℃下松材线虫的冷冻保存方法,比较不同冷冻保护剂对松材线虫低温保存的保护效果,以及解冻后松材线虫的繁殖情况。结果表明:15%甘油对松材线虫保护效果最好,解冻后存活率达36.5%,其次为10%甘油、20%甘油、25%甘油,保护效果最差的是1%二甲基亚砜(DMSO);解冻后线虫能够正常生长繁殖,冻存3天和冻存30天的线虫存活率和繁殖无显著性差异。     

松材线虫与拟松材线虫的几种鉴别方法

在形态、生化与分子以及致病性3个方面综述了松材线虫和拟松材线虫的鉴别方法,旨在为松材线虫病的防治和进出口检疫提供更多更安全的检疫方法,同时为更好的区别两种线虫提供理论依据。     

药剂防治松线虫病的研究

用呋喃丹、克线磷、涕灭威等杀线虫剂进行沟施,防治松树线虫病的效果达９６％～１００％;氧化乐果、果树宝杀虫剂,注射防治松树线虫病的效果为９２％以上;林间应用呋喃丹、涕灭威,其防治效果达６７．５％～１００％,防治后的松林不但枯死率下降,而且生长良好,枝茂叶盛,郁郁葱葱。     

Interspecific hybridization between Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus

Bursaphelenchus xylophilus is the pathogen that causes pine wilt disease, which has greatly damaged forests and ecosystems in countries of East Asia and Europe.Bursaphelenchus mucronatus is closely related to B. xylophilus in morphology and host plant specificity. A longrunning debate has existed regarding whether these two species can successfully produce hybrid offspring. In the present study, we performed in the laboratory, hybridization of two B. xylophilus nematode isolates from China and Japan and three B. mucronatus isolates from China, Japan and France. Nematode isolates of B. xylophilus were successfully crossed with B. mucronatus isolates, and the rate of hybridization was relatively high; however, some hybrid offspring died. Successful hybridization occurred between B. xylophilus and B. mucronatus isolates from China, and 22 generations of hybrids were produced. All F1 hybrids could be backcrossed with their parents and produce offspring. Variation in mucro length among the hybrid offspring and their parents was observed. The hybrid offspring and their parents were inoculated into 3-months-old black pine(Pinus tunbergii) seedlings. Weaker pathogenicity of hybrid offspring was observed compared with that of their parents, and significantly fewer offspring nematodes than parents were reisolated from pines. Therefore, the offspring of B. xylophilus and B. mucronatus may exist in the forest and could influence disease epidemics.     

松材线虫病研究进展

概述了松材线虫的生物学特性、行为学、致病机理等方面的研究动态，并介绍了松材线虫病环境影响评价的研究进展，提出了目前对松材线虫病的环境影响经济评价尚属空白，在松材线虫病对环境影响方面缺乏深入的研究。对其致病主要机理仍不清楚，需进一步进行研究。     

桐庐县松材线虫病预防形势与对策初探

根据桐庐县特定的区域特点，分析了桐庐县松材线虫病预防工作的严峻形势，总结了桐庐县多年来松材线虫病预防工作的实践和取得的成效，并从保护森林生态环境和杭州市旅游西进的战略高度，提出了加强网络建设，强化动态监测；加强内查外拒，严防病源人为传播；加快松林改造，构建自然屏障等预防对策。     

寄生加勒比松松材线虫的鉴定及其致病性测定

运用线虫比较形态学和rDNA—ITS—PCR-RFLP方法对采自广东省广州市白云山加勒比松上的伞滑刃线虫进行鉴定,结果确定该线虫为松材线虫。致病性测定表明该松材线虫种群对加勒比松苗有较强的致病力,接种的松苗均出现不同程度的枯萎,而且从枯死木中可重新分离到该线虫。     

松材线虫病发病过程特征变化的研究

为提高松树病死木松材线虫检出率,及时、准确诊断疫木和疫点,根据病害的外部症状,把松材线虫病的发病过程分为四个阶段,对各阶段的松材线虫分布、松褐天牛发生情况、含水率的变化、木材蓝变情况等特征进行研究。结果表明：病死木上松材线虫的分布由多到少为：在发病前期,上部〉中部〉下部;发病后期,上部〈中部〈下部。松材线虫的数量与松褐天牛老熟幼虫的数量呈正相关,最佳的取样阶段为第Ⅱ和第Ⅲ阶段靠上部梢段取样,第Ⅳ阶段偏下部取样。