猪伪狂犬病病毒双基因缺失gI^-／gE^-／PRV SA738灭活疫苗的安全性与免疫效力

在构建gE和gI双基因缺失猪伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）SA738株的基础上,以绿色荧光蛋白为标志,将gI^-／gE^-／PRVSA738转柒BHK-21细胞,通过蚀斑法得到纯化的gI^-／gE^-／PRVSA738。毒价检测结果显示,TCID50由7．25下降至5．75,表明该病毒已被弱化,与预期结果相当。将该病毒灭活后,以不同滴度接种无母源抗体仔猪及妊娠母猪,安全性检测表明,gI^-／gE^-／PRVSA738对仔猪体温、生长,对妊娠母猪产仔及仔猪健康状况均无影响。随后将灭活的gI^-／gE^-／PRVSA738与弗氏佐剂混合乳化,分别接种家兔与仔猪,免疫后7、14、21、28d采血分离血清。经ELISA检测,家兔免疫后14d、仔猪免疫后7d均显示阳性,对照组均为阴性。抗体中和试验表明,家免免疫后14d抗体水平比7d显著升高,但至21d,抗体升高不明显;仔猪抗体水平至28d,中和抗体水平达到1：262．23,与21d相比差异极显著。免疫后28d,采用100LD50 PRV强毒攻击动物,进行免疫保护性试验,结果显示,家兔免疫组只有一只出现轻微的一过性临床症状,未出现死亡,而对照组出现了奇痒等较重的临床症状,且于5d后全部死亡;仔猪对照组攻毒后2d,出现了精神高度沉郁、不食、呕吐与腹泻等症状,并于5d后死亡;免疫组攻毒后3d,出现轻微食欲不振、精神萎靡、腹泻等症状,且于攻毒后6d恢复正常,免疫保护率为100％。以上结果表明,该gI^-／gE^-／PRVSA738-突变株有效诱导了机体的保护性免疫应答。     

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验

为了掌握猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用4种不同的免疫程序,对250头母猪和1000头仔猪进行了免疫试验。试验期间,按比例定时采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测,证明猪伪狂犬gE基因缺失疫苗,无论国产苗或进口苗都可以产生良好的免疫效果;无论跟胎免疫、1年2次普免,每隔4个月定时免疫,效果均良好。种猪免疫抗体合格率达100%,仔猪49日龄前抗体合格率达100%,75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为了使猪体免疫力更强,不给野毒入侵的机会,建议仔猪在首免后,适当时间进行二次加强免疫。而只给公猪、母猪春秋两季免疫,不给仔猪免疫组,仔猪在35日龄后抗体降为阴性,不能抵抗野毒的侵袭,这种免疫方法不宜推广。     

伪狂犬病病毒TK、gE双基因缺失传代致弱株的安全性及免疫效力研究

为获得安全、有效的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株弱毒疫苗,在前期研究的基础上,对PRV变异株TK、gE双基因缺失株(PRV LA1206株)进行传代致弱,在鸡胚成纤维细胞上连续传代75次,后经连续5代挑取单个病毒蚀斑克隆而得F₈₀代,毒种命名为PRV LA1206-80株,并对其进行安全性及免疫效力评价。生长动力学试验结果显示,PRV LA1206-80株与PRV LA1206株生长动力学相似。仔猪安全性试验结果显示,滴鼻接种1日龄PRV抗体阴性仔猪后所有仔猪均未出现发热及临床症状,表明该毒株对1日龄仔猪安全。攻毒保护试验结果显示,28～35日龄仔猪肌肉注射接种PRV LA1206-80株或PRV LA1206株7 d后进行变异株PRV AH02LA株滴鼻攻毒,可产生良好保护,所有仔猪均未出现体温反应、临床症状和排毒。而PRV Bartha K61株免疫猪7 d后攻毒,均出现了体温反应,其中1头发病,且鼻拭子样品均检出病毒。综上所述,相较于PRV LA1206株,在鸡胚成纤维细胞上连续传代后获得的PRV LA1206-80株已...     

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。     

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验

为了掌握猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用4种不同的免疫程序,对250头母猪和1000头仔猪进行了免疫试验。试验期间,按比例定时采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测,证明猪伪狂犬gE基因缺失疫苗,无论国产苗或进口苗都可以产生良好的免疫效果;无论跟胎免疫、1年2次普免,每隔4个月定时免疫,效果均良好。种猪免疫抗体合格率达100%,仔猪49日龄前抗体合格率达100%,75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为了使猪体免疫力更强,不给野毒入侵的机会,建议仔猪在首免后,适当时间进行二次加强免疫。而只给公猪、母猪春秋两季免疫,不给仔猪免疫组,仔猪在35日龄后抗体降为阴性,不能抵抗野毒的侵袭,这种免疫方法不宜推广。     

伪狂犬病病毒gE／gI双基因缺失株的生物学特性

为了解gE和gI双基因缺失株伪狂犬病病毒gE-／gI—PRVSA738和野毒株PRV—SA的生物学特性,对该病毒进行了理化特性和体外增殖曲线的研究。结果显示：该缺失株对氯仿、酸、热及冻融次数敏感,从双基因缺失毒株与野毒株在BHK-21细胞上的增殖曲线来看,在病毒培养50h之前野毒株的毒价均高于缺失株,而在50h以后缺失株的毒价又高于野毒株,并且在36h时2株病毒的毒价均达到最高峰。     

伪狂犬病基因缺失疫苗研究进展

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的家畜及野生动物的急性传染病,其特征为发热、奇痒及脑脊髓炎。本病广泛分布于世界各国。近年来,猪、牛及绵羊发生本病逐年增加,我国不少省区也有本病发生,尤其是猪的发病有扩大蔓延趋势。 许多西方发达国家早在20世纪80年代就制定和启动了猪伪狂犬病的根除计划,并通过广泛使用基因缺     

不同伪狂犬病活疫苗免疫效力比较

为临床科学选用疫苗,对来自三个生物制品厂的伪狂犬病活疫苗的免疫效力进行了评价。试验选取35日龄伪狂犬阴性猪20头,试验根据疫苗接种情况分为5组,分别为:免疫疫苗稀释液的对照组(第一组)、免疫进口活疫苗组(第二组)、免疫国产活疫苗组(第三组)、免疫本公司ST细胞系增殖制备活疫苗组(第四组)、免疫本公司鸡胚成纤维细胞增殖制备活疫苗组(第五组),然后进行免疫监测和效力评价,观察不同疫苗组仔猪的抗体水平后攻毒保护情况。结果显示:一次免疫后各组抗伪狂犬病毒抗体水平增长缓慢,进行二次免疫后,抗体水平迅速增加并保持较高水平。攻毒后,从身体耐受性、体温变化、体重下降率以及g E抗体水平来看,第二组疫苗B和第四组疫苗D耐受性较强,较快恢复健康,体重下降率较小且g E抗体水平较高。     

伪狂犬病病毒gI/gE双缺失通用转移载体的构建与初步应用

对含伪狂犬病病毒（peudorabies virus,PRV)Ea株gI、gE、11K全基因，gD、28K基因部分编码区的质粒pSK4.5进行改造，消除其中的BamH1和Not1位点，将晚期基因gG的启动子、多克隆位点以及SV40poly(A)同时插入改造后的质粒pSKBN的Stu1和BstEⅡ位点，取代gI和gE的部分编码区，构建了由gG启动子驱动的gI/gE双缺失通用转移载体pgGIE-Uni。序列分析进一步证实，至少有8个单一酶切位点可供外源基因直接插入，上下游倒翼分别为0.8kb和2.4kb。将猪繁殖-呼吸障碍综合征（兰耳病）主要抗原基因ORF5插入pgGIE-Uni的BamHI和Not1位点之间，构建了含ORF5的转移质粒pgGIE-ORF5。上述结果为进一步研制猪伪狂犬病-兰耳病的2价基因工程疫苗奠定了基础。     

重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5)对绵羊的安全和效力试验

为了验证表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5)的安全性和免疫原性,将10只5～6月龄健康绵羊分成三组,安检组(3只)肌注108.0PFU/只、效检组(4只)肌注106.0 PFU/只,3只作为不接种对照组.接种后14 d,效检组与对照组每只臀部肌注伪狂犬病病毒"双城系"猪源强毒S株103 LD50,结果效检组全部保护,对照组全部死亡,安检组未见异常.结果表明,重组病毒完全符合伪狂大病活疫苗制造及检验规程中对疫苗的安全和效力检验标准.     

猪伪狂犬病病毒gD核酸疫苗构建及IL-15基因佐剂对其免疫增强试验

运用PCR技术扩增出伪狂犬病病毒糖蛋白gD基因,将该基因定向克隆于真核表达载体pcDNA3.1+、pCI-neo中,命名重组质粒为pcD-gD、pCI-gD.以小鼠为动物模型,对构建的基因疫苗进行免疫原性的初步评价.为了证明细胞因子是否能增强基因疫苗的免疫效力,本试验用IL-15的表达质粒联合pcD-gD、pCI-gD免疫.结果表明,重组质粒组主要提高细胞免疫水平,特别是联合组中的CD8~+相对其他组别较高.重组质粒在体液免疫方面没有表现出优势,抗体滴度达不到阳性对照组的水平,但是整个抗体水平相对稳定,提示DNA疫苗诱导的抗体维持时间较长.     

伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建

在伪狂犬病病毒转移载体pBdTK-Uni的多克隆位点中插入由SV40启动子控制下的IacZ基因表达盒,同时在右侧同源臂下游插入一个1.7kb的KpnI片段,构建成一个新的转移载体pUhi-LacZ.用该载体与Bartha-K61株基因组通过脂质体法共转染Vero细胞,经过10代蓝斑筛选纯化和PCR鉴定获得了一株稳定表达LacZ基因的伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株,命名为rPrV-LacZ.在不同的细胞(PK-15、IBRS-2、Vero和CEF)上,对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和细胞病变进行比较,未见显著差异.结果表明转移载体pBdTK-Uni具有实用性,可用于构建伪狂犬病病毒基因工程活载体疫苗.     

猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定

从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒。该病毒株感染Vero细胞、MDCK细胞均可产生典型的细胞病变,并可见合胞体。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25d,可检测到伪狂犬病抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状。电镜观察可见110～180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。用MDCK细胞测定其TCID50为10-6.604/0.1mL,能被PRV标准阳性血清所中和,效价为1∶77。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH5.0～9.0之间保持稳定。尿囊膜接种9～12日龄鸡胚,86h可见尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。制作细胞飞片,8h用PRV荧光抗体染色,可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。PCR反应可扩增出特异性1579bpDNA片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并命名为PRVFZ株。     

致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系（PK-15）分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第24代毒价达10^8.5 TCID50／mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110nm～150nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150nm～180nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因,其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7％～100％。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24h～72h内全部死亡。研究表明,PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。     

膜分离法纯化浓缩猪伪狂犬病疫苗毒的效果

本研究使用不同孔径的陶瓷(有机)膜过滤器,对不合格的猪伪狂犬病毒细胞收获液(病毒含量≤104TCID50/mL)滤除杂蛋白、超滤浓缩、除菌处理得到纯化浓缩的猪伪狂犬病疫苗病毒液;然后对纯化浓缩的猪伪狂犬病疫苗病毒液分别进行杂蛋白去除率检验与无菌检验、病毒含量测定、安全检验、效力检验;将检验合格的纯化浓缩的猪伪狂犬病疫苗病毒液添加保护剂冻干,并对纯化浓缩的猪伪狂犬病冻干活疫苗进行以上各项检验,以及进行免疫猪体内抗体消长变化的检测。结果表明:纯化的猪伪狂犬病疫苗杂蛋白去除率平均达到68.3%以上,病毒含量≥105TCID50/mL,效力检验合格;免疫猪体内抗猪伪狂犬病毒抗体增长幅度比同时期未纯化的常规疫苗显著,其中免疫至84 d时中和抗体效价平均高达40.35稀释倍数左右,比常规疫苗中和抗体效价平均高出14.22稀释倍数。此项研究为畜禽疫苗的纯化提供一定的参考。     

鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株安全性和免疫效力初步评价

通过对QX基因型IBV分离株SDZB0808进行鸡胚连续100次传代致弱后获得子代病毒P100。为了明确P100的的致弱效果和免疫原性,对其进行了安全性和免疫效力评价。安全性试验结果显示,P100以105.5 EID50/只的剂量对3日龄的SPF鸡进行免疫后试验,与正常对照组相比没有明显临床症状和病理变化,气管和肾脏组织也没有病理组织损伤。免疫效力试验结果发现,P100以104.5 EID50/只的剂量免疫3日龄SPF鸡,14d后对同源强毒SDZB0808和异源强毒SDIB821/2012的攻击都具有100%的临床保护,病理组织学检查发现P100免疫攻毒组试验鸡气管和肾脏与正常对照没有差异,排毒检测结果显示P100免疫攻毒组试验鸡内脏组织病毒检出率大大低于攻毒对照组。本研究结果表明P100对SPF鸡具有良好的安全性和免疫效力,可以作为IBV弱毒疫苗候选株。     

猪伪狂病病毒粤A株gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株gE基因进行了PCR扩增,PCR产物克隆到PMD18-T载体.对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性,并与2株不同来源的毒株进行了同源性分析和比较.