实时定量PCR快速检测对虾白斑综合症病毒

根据对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和Taqman探针,建立了WSSV的实时定量PCR检测体系.构建含有WSSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,结果表明标准品浓度在1.5×107～1.5×101个拷贝之间有"S"型扩增曲线,检测限为15个拷贝.标准曲线中模板浓度(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.77 lgX+43.73,相关系数R2=0.9967.该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)以及对虾基因组DNA没有扩增反应.运用该方法对100尾对虾样品进行检测,14个对虾样品为阳性.而运用巢式PCR检测只有4个对虾样品为阳性.实时定量PCR方法检测WSSV,快速、特异、灵敏,在虾病的临床检测上具有重要意义.     

实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立

[目的]建立Taqman探针荧光定量RT-PCR检测传染性胰脏坏死病病毒（IPNV）的方法。[方法]选取IPNV病毒的基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物与探针。以梯度稀释的含有IPNV目的扩增片段的质粒作为标准品,探索定量RT-PCR反应条件。[结果]当标准品浓度在102～106 copies/μl之间时,标准品浓度（X）与Ct的关系为Ct=-3.426 lgX＋4.481,相关系数R2为0.999 8。该法对病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）、鲤春病毒血症病毒（SVC）和流行性造血器官坏死病病毒（EHNV）,草鱼呼肠孤病毒（GCRV）,大鳞大麻哈鱼胚胎细胞（CHSE-214）和虹鳟的核酸都没有扩增反应。[结论]该检测方法灵敏度高,特异性好,可用于鱼类传染性胰脏坏死病病毒的快速定量检测。     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和 TaqMan探针,构建分别包含 PCV2 ORF1和 ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于 PCV2 ORF1和 ORF2的TaqMan荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的 Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数 R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101 copies/μl,ORF2方法可达1.0×102 copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在 P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

产志贺毒素大肠杆菌stx2基因荧光定量PCR检测方法的建立及应用(英文)

[目的]建立检测产志贺毒素性大肠杆菌(STEC)stx2基因荧光定量PCR方法。[方法]根据GenBank中已发表的STEC stx2基因序列,在保守区域设计PCR引物和探针,构建重组质粒作为阳性模板,优化反应条件,建立荧光定量PCR方法。[结果]利用优化的荧光定量PCR反应体系建立了标准曲线。表明起始模板浓度与Ct值之间线性关系好,相关系数R2均达0.995以上;此方法特异性好,对10种非STEC肠道病菌无特异性扩增;敏感性高,初始模板的检出下限达1.0×102拷贝数/μl;重复性好,批内、指间变异系数均分别小于1%和5%。[结论]该研究成功建立了检测STEC stx2基因的荧光定量PCR方法,为快速检测样品中STEC提供了技术手段。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉历基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法.[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针.然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.[结果j抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X 43.783 512,相关系数R2为0.997 867.[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点.     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较（英文）

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和Taq Man探针,构建分别包含PCV2 ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于PCV2 ORF1和ORF2的Taq Man荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μl,ORF2方法可达1.0×102copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的]采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数。[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数。[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x＋35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x＋34.890,R2=0.999。nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝。[结论]该研究为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据。     

实时荧光定量PCR法检测草莓镶脉病毒

为了建立一种特异、灵敏、快速检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据已有的检测SVBV的引物信息,合成引物,对不同草莓品种进行PCR扩增。经过克隆、测序及序列比对得到了感染SVBV的阳性植株,利用此植株PCR扩增产物构建重组质粒作为标准品,优化了PCR反应体系,标准曲线的循环阈值（Ct值）与模板浓度有良好的线性关系（R2=0.999 1）;进行了灵敏度和重复性试验,敏感性可达到101拷贝·μL-1,约为普通PCR的1 000倍,重复性好;并与常规PCR方法进行了比较,成功建立了检测SVBV的实时荧光定量PCR法。用该方法检测了部分草莓品种的DNA样品,结果表明,大部分植株都带有SVBV。该方法具有很高的灵敏性和重复性,可用来快速检测草莓植株是否感染SVBV。     

碘化钾还原法测定自然水体中微量过氧化氢的研究

[目的]优化碘化钾还原法测定过氧化氢的试验条件,测定天然水体中的过氧化氢含量。[方法]对试验过程中的影响因素：温度、时间、pH、碘化钾及催化剂钼酸铵用量进行优化,选择过氧化氢的最佳测定条件。[结果]在pH为4～6、室温25℃、添加4 ml碘化钾及催化剂钼酸铵100μl、反应时间15 min条件下0,～2.0×10-4mol/L范围内过氧化氢的浓度与吸光度成线性相关（R2=0.999 8）,最小检测限为1.5×10-6mol/L,所测自然水体中过氧化氢测的量为5.29～10.59×10-6mol/L。[结论]该方法简单、快捷,可用于自然水体中微量过氧化氢的测定。     

中华绒螯蟹白斑症病毒病的诊断

[目的]对江苏省吴中地区养殖池塘患病的中华绒螯蟹进行诊断。[方法]结合临床流行病学调查和分子生物学鉴定,对江苏省吴中地区发病的中华绒螯蟹进行实验室检测与鉴定。参考Gen Bank中白斑症病毒(WSSV)的基因序列设计1对特异性引物,以从中华绒螯蟹的鳃、肝胰腺、肌肉等组织提取的DNA为模板,进行PCR扩增。[结果]经过解剖观察,发现病蟹内脏器官无明显变化。从病蟹的肝胰腺和肌肉中未分离到致病菌。通过PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物,测序比对显示扩增条带的基因序列与WSSV的基因序列同源性高达99.6%。病理切片显示鳃和肝胰腺可见大量细胞核肿大细胞,与WSSV引起对虾组织的病变相一致。[结论]经初步诊断,确定引起中华绒螯蟹发病死亡的病原为WSSV。     

鸡舍环境镰孢菌的定量研究

[目的]对鸡舍空气和周围基质(饲料、粪便、灰尘、土壤)中镰孢菌(Fusarium)的浓度和分布进行定量研究,为控制从业人员和禽类Fusarium感染及预警提供科学依据。[方法]采用6级Anderson空气微生物采样器和曝皿法采集空气中样本,采用无菌袋随机采取周围基质中样本,进行实验室培养、计数、纯化。[结果]共得到镰孢菌分离株717株,以灰尘中Fusarium的浓度最高(2.8×105~1.5×106cfu/g,平均为8.8×105cfu/g)。[结论]空气中的镰孢菌分布与土壤中和灰尘中镰孢菌相关性较大。     

栉孔扇贝和虾夷扇贝通用微卫星引物的筛选及其在杂种鉴定中的应用

[目的]为进行大规模栉孔扇贝×虾夷扇贝群体的杂种鉴定以及家系中的亲子鉴定提供了基础。[方法]将已发表的25对虾夷扇贝的微卫星引物在栉孔扇贝基因组DNA上进行PCR扩增,并利用筛选出的通用引物对栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝(♂)进行杂种鉴定。[结果]通过PCR扩增,筛选出6对引物获得扩增产物,其中2对表现为多态性。将这6对具有属间通用性的微卫星引物对栉孔扇贝(♀)×虾夷扇贝(♂)进行PCR扩增,均能扩增出特异性条带,其中引物P13F449和KMY134的扩增产物中可以明显地分辨出来自父母本群体的特有条带,从而确定了杂交子代的杂种身份。[结论]虾夷扇贝和栉孔扇贝间通用微卫星引物是存在的,而且部分引物可以直接用于属间杂种的鉴定。     

优异纤维品质陆地棉品种与转基因抗虫棉品种的配合力分析

[目的]探索抗虫杂交棉高产、优质、抗虫同步改良方法。[方法]利用10个优异纤维品质陆地棉品种和6个转Bt基因抗虫棉品种配组的10×6 NCII交配设计,对其产量、品质及抗虫性的配合力进行分析。[结果]Bt基因能在F1得到显性遗传,遗棉2号具有最好的产量性状一般配合力,AcalaSJ-3具有最好的纤维品质性状一般配合力,苏联8908×32B、Acala(1)×中棉所30等组合的各性状特殊配合力较好,亲本的一般配合力与组合间特殊配合力不存在显著相关性。     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

嘉陵江下游短体副鳅繁殖群体结构的研究

[目的]研究短体副鳅繁殖群体的结构特征,积累副鳅属鱼类的生物学资料。[方法]对采自嘉陵江的208尾繁殖季节的短体副鳅成熟个体年龄、体长、体重及雌雄生长特性等进行研究。[结果]繁殖群体的性比为♀∶♂=5.71∶1.00。繁殖群体由1~5龄鱼组成,以2~3龄组为主。短体副鳅的体长范围为49.0~84.0 mm,体重范围为2.6~11.0 g。最小性成熟年龄是1龄;最小性成熟个体雌性体长49.0mm,体重2.6 g;雄性体长55.5 mm,体重3.7 g。群体体重（W）与体长（L）的关系：雌＋雄为W=0.000 2×L2.477 2;雌为W=7.0×10-5×L2.753 5;雄为W=0.002 1×L1.896 4。生长系数雌性大于雄性;繁殖群体（雌＋雄）的生长系数b=2.477 2〈3,说明短体副鳅个体发育正常呈异速生长趋势。[结论]短体副鳅的生长峰值均出现在性成熟后1~2年内,最佳捕捞期应该在3龄以后。