几种植物病原真菌致病毒素的初步研究（Ⅰ）

试验明确了玉米大斑病、小斑病、圆斑病，小麦根腐病、赤霉病病菌毒素的基本特性，病原菌培养滤液的致病作用，制备方法，影响毒素作用的因素，稳定性以及评定毒素测定的生物测定方法，为保证毒素作用的隐定性，制定出了一套系统的规范化的毒素制备程序。     

苏云金芽孢杆菌CrylAc原毒素、毒素制备及其对棉铃虫的毒力测定

对提取苏云金芽孢杆菌CrylAc原毒素与活化毒素的制备方法进行了改进,经牛胰蛋白酶作用后用等电点沉淀法和纯化法获得毒素。对样品进行SDS-PAGE分析,并测定其对棉铃虫初孵幼虫的毒力。结果表明制备的CrylAc原毒素和毒素降解较少,杀虫活性高。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac原毒素、毒素制备及其对棉铃虫的毒力测定

对提取苏云金芽孢杆菌Cry1Ac原毒素与活化毒素的制备方法进行了改进,经牛胰蛋白酶作用后用等电点沉淀法和纯化法获得毒素.对样品进行SDS-PAGE分析,并测定其对棉铃虫初孵幼虫的毒力.结果表明制备的Cry1Ac原毒素和毒素降解较少,杀虫活性高.     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

尖孢镰刀菌毒素的初步研究

引起大豆根腐病的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的不同菌株产毒量不同，毒素具有较强的热稳定性。用两种方法提取毒素，结果表明用炭吸附法提取的毒素量多于乙酸乙酯萃取法。生物活性测定表明：该毒素对大豆胚根有明显的抑制作用，对大豆一出复叶期幼苗有致萎作用。尖孢镰刀菌毒素不仅对大豆种子萌发、胚根生长有抑制作用，对其它作物种子萌发、胚根生长也有抑制作用。     

稻曲病菌粗毒素的初步研究

稻曲病菌在生长过程中能产生有毒物质，本文研究了稻曲病菌粗毒素的制备及生物测定方法。结果表明，以PD为液体培养基振荡培养21d后经离心、过滤、高压灭菌制得的粗毒素对水稻种子的萌发、幼苗生长及愈伤组织的生长具有毒害作用。其可以作为抗性突变体筛选的选择压力进行抗稻曲病育种。     

水杉色二孢毒素生物活性研究

水杉枯萎病病原菌色二孢（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｓｐ）真菌可以产生有毒代谢物。生物测定结果表明：该毒素具有广谱性，对裸子植物水杉和池杉、被子植物中杨柳科的垂柳、安石榴科的石榴等树木枝条具致萎作用，对小麦、玉米、油菜等种子的发芽及生长具有一定的抑制作用。粗毒素透析及稳定性测试表明：该毒素成分复杂，包括可以透过和不能透过半透膜的组分，具有很强的热稳定性，但在室温下放置长时间后活性会降低。     

稻瘟病菌粗毒素的制备及其致病力的测定

同一条件下制备的稻瘟病菌粗毒素对水稻种子萌芽，种子胚芽，胚根的伸长都有明显的抑制作用并随粗毒素浓度的升高，抑制率增大，对水稻愈伤组织也有明显的毒害作用。     

茄子黄萎病菌的研究及其毒素的生物测定

从闵行区虹桥乡茄子上分离到的Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ，经过接种试验、形态鉴定、温度测定后确定为Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅｋｌｅｂ，并且用查氏液体培养该菌制成粗毒素对茄苗进行毒性测定。结果表明所制备的粗毒素对茄苗具有毒害作用，毒素经６０℃温度处理４２ｈ，其毒性仍保持不变．     

稻瘟病菌粗毒素的制备及其对水稻毒性的测定

PO_9稻瘟病原菌的菌丝悬浮液和孢子悬浮液,经无菌滤取和高压灭菌制备成稻瘟病菌粗毒素。采用浸根处理、心叶注射、叶肉注射、穗苞注射和叶面喷布5种方法,测定所制备的2种粗毒素对水稻的毒性。结果表明,本试验制备的粗毒素对水稻的根、叶、穗的幼嫩组织有较强的毒性;粗毒素经高温高压后,毒性略有减低;不同材料制备的粗毒素对水稻的毒性以菌丝悬浮液的较强。文中还讨论了稻瘟病菌毒素的毒性、制备及应用等。     

番茄煤霉病菌致病毒素提取及其活性测定

采用3种方法提取毒素,结果表明:活性碳法、有机溶剂法、硫酸铵分级沉淀法均提取到毒素,硫酸铵分级沉淀法是比较简便而有效的方法。生物测定结果表明:该毒素对番茄幼苗及叶片具有致萎作用。针刺叶片可产生褪绿斑。滤液透析及热稳定性测试结果表明:该毒素为大分子化合物,这与用有机溶剂提取毒素所得结果一致,同时测得它具有很强的热稳定性。     

茄子黄萎病菌的研究及其毒素的生物测定

从闵行区虹桥乡茄子上分离到的Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ，经过接种试验，形态鉴定，温度测定后确定Ｖｅｒｔｉ－ｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅｋｌｅｂ，并且用查氏液体培养该菌制成粗毒素对茄苗进行毒性测定，结果表明所制备的粗毒素对茄苗具有毒害作用，毒素经６０℃温度处理４２ｈ其毒性仍保持不变。     

运用致病毒素筛选抗稻曲病突变体的研究

通过4个品种水稻愈伤组织的诱导、继代与分化,研究了稻曲病病原菌粗毒素为选择压力进行抗稻曲病突变体的筛选的可行性。结果表明,供试的水稻各品种在细胞水平的抗性与田间的抗性相一致,因而可以以制备的稻曲病菌粗毒素为选择压力进行抗病突变体的筛选。对得到的抗性愈伤组织的抗性稳定性进行了鉴定。结果表明,继代后愈伤组织的抗性仍得到了保持并得到了分化植株。这说明毒素筛选体系是目前最成熟的一种方法。     

T2毒素人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定T 2毒素人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源T 2毒素多克隆抗血清。采用琥珀酸酐法将T 2毒素活化为T 2HS,T 2HS在碳二亚胺(EDC)作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联,合成免疫抗原T 2 BSA和检测抗原T 2OVA,经鉴定后,分别按30、50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后1次免疫10d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定其敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达到了1∶104以上,2号小鼠多抗血清的敏感性最好,其半数抑制质量浓度(IC50)为324ng/mL,且具有良好的特异性。成功合成了T 2毒素人工抗原,制备了多克隆抗体血清,为T 2毒素单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

诱发玉米抗小斑病突变体的研究 Ⅲ、影响玉米小斑病菌致病毒素作用的因素与生物测定

试验比较了几种致病毒素诱变剂,以病叶冰冻提取液和改良 Fries 培养滤液的效果最理想,高粱米粒培养物的甲醇和蒸馏水提取液效果不理想。为防止致病毒素作用变化、制备诱变剂的小斑病菌最好用病叶保存。用改良 Fries 培养液培养小斑病菌每天振荡六次,每隔1小时一次、每次10分钟。所制备的培养滤液在5℃下可贮存六个月、用高压灭菌器灭菌30分钟及煮沸浓缩均不影响致病毒素的作用。评价致病毒素作用以比较抑制种子根生长的种苗萌发包法效果最好。愈伤组织无性系和试管苗抗病性的测试可用定量孢子的纸片法。     

临床粪便标本中艰难梭菌毒素免疫学稳定性研究

目的探讨不同贮存温度下临床粪便标本中艰难梭菌毒素的免疫学稳定性。方法应用酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)试剂盒检测定量聚合酶链式反应确认为艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)的粪便标本中艰难梭菌毒素含量。将EIA阳性标本置于4、-20、-80℃有氧条件下储存,在储存的第1、14、30、60、90、120天通过EIA法测定毒素含量。结果共收集43例患者粪便标本,定量聚合酶链式反应检测出CDI阳性标本7例(16.28%),其中4例EIA检测为艰难梭菌毒素阳性,毒素含量差异较大;未使用储存缓冲液的粪便标本中艰难梭菌毒素稳定性较好,相同温度下使用储存缓冲液的粪便标本中艰难梭菌毒素稳定性较差、降解较快,-20℃时稳定性最差。结论不同储存温度对未使用储存缓冲液的临床粪便标本艰难梭菌毒素的免疫稳定性没有明显影响。但稀释保存不利于毒素稳定性,尤其是-20℃,临床中应避免使用该储存温度。     

暗孢节菱孢菌非蛋白类毒素的基本性质研究

用改进的Fries培养基在最佳条件下培养出的暗孢节菱孢菌[Arthrinium phaeospermum(corda)M.B.Ellis]滤液,采用硫酸铵沉淀制备蛋白类、非蛋白类粗毒素。经致病性检测,前者生物活性低于后者小分子毒素成分。基本性质研究显示非蛋白粗毒素有一定专化性,但专化性不强,介于专化性与非专化性毒素之间;具有较强的热和紫外线稳定性、对pH敏感,易受碱性物质影响;9种不同极性物质对毒素的生物活性有不同影响,该毒素可能为极性较大的物质。     

真菌毒素制备过程中应注意的几个问题

总结了真菌毒素制备过程包括产毒素菌株的培养，真菌毒素的分离和提纯以及毒素的生物检测中应注意的几个问题，为真菌毒素的进一步研究打下了基础。     

间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析(CI-TRFIA)方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明:获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度(IC10)为0.074 ng·mL-1,中抑制浓度(IC50)为60.16 ng·mL-1,线性检测范围(IC20~IC80)为0.96~1 633.60 ng·mL-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论:该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。     

间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析(CI-TRFIA)方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明:获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度(IC10)为0.074 ng·mL-1,中抑制浓度(IC50)为60.16 ng·mL-1,线性检测范围(IC20~IC80)为0.96~1 633.60 ng·mL-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论:该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。