由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻

摘要:将具有广谱抗病作用的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase , GO）基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建了水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza. sativa L.ssp.japonica )品种日本晴(Nipponbare)的幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得潮霉素抗性水稻植株的Southern杂交分析表明，GO基因已整合到受体基因组。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能。抗病性鉴定表明，所得转基因水稻对稻瘟菌(Magnaporthe grisea )具有良好的抗性。     

Orosensory stimulation effects on human saliva proteome

Saliva flow induced by 6-gingerol (pungent), hydroxy-α/β-sanshools (tingling), and citric acid (sour) was measured, and the time-dependent changes in the whole saliva proteome were analyzed by means of 2D-PAGE, followed by tryptic in-gel digestion and MALDI-TOF-MS peptide mass fingerprint analysis. The proteins showing significantly decreased abundance after oral 6-gingerol stimulation were identified as glutathione S-transferase P, the heat shock protein β-1, the heat shock 70 kDa protein 1, annexin A1, and cytoplasmic β-actin, whereas prolactin inducible proteins (PIP), short palate, lung and nasal epithelium carcinoma-associated protein 2 (SPLUNC2), zinc-α-2-glycoproteins (Zn-α-GP), and carbonic anhydrase VI (CAVI) were found with increased abundance. As the effects of this study were observed instantaneously upon stimulation, any proteome modulation is very likely to result from the release of proteins from preformed vesicles and not from de novo synthesis. The elevated levels of SPLUNC2, Zn-α-GP, and CAVI might be interpreted to trigger innate protective mechanisms in mucosal immunity and in nonimmune mucosal defense and might play an important role during the initial stage of inflammation.     

仔猪水通道蛋白基因的克隆及断奶应激对其在胃肠道组织mRNA表达的影响

水通道蛋白(AQP)作为一种膜转运蛋白,对于调控肠道组织的水分子转运具有重要作用。本实验利用同源序列克隆法设计引物,从仔猪(Susscrofa)的消化道组织中克隆AQPs家族基因(AQP2~AQP11)(GenBank登录号分别为EU636238、EU161094、EU165525、EU192130、EU620575、EU024116、EU220426、EU220427、EU582021和EU220425),并对其进行生物信息学分析。采用荧光定量PCR研究断奶应激对于仔猪胃肠道组织中AQP1、AQP3、AQP8和AQP11的mRNA表达影响。生物信息学分析发现,猪AQPs家族基因含有高度保守的天冬酰氨-脯氨酸-丙氨酸(NPA)结构序列,基因表达分析发现,断奶组仔猪的AQP1基因在十二指肠、回肠和结肠组织的mRNA表达量与对照组相比显著上调(P<0.05);AQP3基因在胃和小肠组织的mRNA表达有显著上调(P<0.05);AQP8基因在胃和回肠组织中mRNA表达有显著上调(P<0.01),在其他组织中没有显著差异;AQP11基因在空肠组织的mRNA表达量显著上调了1.7倍(P<0.05)。这些研究结果表明,AQP基因可能在断奶应激引起的仔猪肠道腹泻中发挥重要作用。     

Profiling of hepatic gene expression of mice fed with edible japanese mushrooms by DNA microarray analysis: comparison among Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa, and Hypsizigus marmoreus

To compare and estimate the effects of dietary intake of three kinds of mushrooms (Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa, and Hypsizigus marmoreus), mice were fed a diet containing 10-14% of each mushroom for 4 weeks. Triacylglycerol in the liver and plasma decreased and plasma cholesterol increased in the P. ostreatus-fed group compared with those in the control group. Cholesterol in the liver was lower in the G. frondosa-fed group than in the control group, but no changes were found in the H. marmoreus-fed group. DNA microarray analysis of the liver revealed differences of gene expression patterns among mushrooms. Ctp1a and Fabp families were upregulated in the P. ostreatus-fed group, which were considered to promote lipid transport and β-oxidation. In the G. frondosa-fed group, not only the gene involved in signal transduction of innate immunity via TLR3 and interferon but also virus resistance genes, such as Mx1, Rsad2, and Oas1, were upregulated.     

牛白细胞介素1受体相关激酶2（IRAK2）基因的克隆及生物信息学分析

Toll样受体 (toll-like receptors,TLRs)可识别病原体相关分子模式,通过下游信号转导激活免疫细胞,在天然免疫和适应性免疫应答中起着重要的作用,而白细胞介素1受体相关激酶2(interleukin-1 receptor-associated kinase 2,IRAK2)为TLRs信号转导通路下游重要的分子,起着信号转导与调控作用。为了深入研究牛TLRs信号转导通路对牛病原体所致疾病抗性中的主要作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了牛IRAK2基因的cDNA和进行了基因表达谱分析,并对其基因序列和所编码的蛋白质的结构特征进行了生物信息学分析。结果表明,牛IRAK2基因在乳腺、肝、十二指肠、脂肪、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达,其序列全长为2 148 bp(GenBank登录号为EU528620),包括36 bp的5'非翻译区（1~36）,1 866 bp的CDS区（37~1 902）和246 bp的3'非翻译区（1 903~2 148）,编码622个氨基酸,其分子量为68 628.31 D,等电点为5.3。IRAK2蛋白含有一个DD结构域和一个S_TKc结构域,位于细胞核、细胞质、线粒体和质膜上,通过DD和S_TKc结构域对TLRs的信号转导有着重要的作用。     

半定量RT-PCR法评定鸡小肠肽转运载体PepT1基因的表达

摘要：根据鸡肽转运载体cPepT1 mRNA和看家基因β-actin mRNA序列，分别设计cPepT1和β-actin 引物各1对，并通过Mg2+浓度、循环数等PCR条件的优化，建立了包括RNA提取、反转录、PCR的鸡小肠cPepT1基因表达检测方法。采用该方法研究了肉仔鸡cPepT1基因在小肠各段的表达差异。结果显示，肉仔鸡小肠cPepT1表达水平表现为随小肠近端到远端显著降低的趋势，回肠表达水平显著低于十二指肠和空肠，十二指肠和空肠差异不显著。     

拟南芥生态型Tor-1根系响应镉的转录组学与可变剪接分析

  【目的】  研究拟南芥生态型根系对镉 (Cd) 的适应性机制,挖掘耐Cd基因,为培育修复型植物提供生理基础和理论指导。  【方法】  本研究以高Cd积累同时高耐受性的拟南芥生态型Tor-1为试验材料,测定Cd处理后根系的生理变化、氧化应激反应、抗氧化酶活性,结合转录组学和可变剪接分析,以期从分子水平上解析Tor-1根系对Cd的适应性机制。  【结果】  Cd处理后,拟南芥生态型Tor-1的主根长度和根尖数没有明显差异,但根系总体积、总表面积显著降低,总根长极显著下降,表明根系受到损伤;根系丙二醛浓度较对照有所增加,但变化不显著;脯氨酸浓度显著下降;超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化氢酶 (CAT) 活性显著增加。基因本位论 (GO) 富集分析显示,在生物过程中,差异表达基因 (DEGs) 在代谢过程和对化学物质的反应功能富集最为显著;在细胞组分中,DEGs在细胞外组分功能显著富集;在核酸功能中,DEGs在氧化应激活性和血红素结合功能显著富集。京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路表明,高比例诱导的DEGs富集于7条KEGG途径,分别为苯丙素生物合成 (4.49%)、次生代谢物的生物合成 (14.45%)、代谢途径 (20.57%)、硫代葡萄糖苷 (GS) 生物合成 (0.89%)、谷胱甘肽 (GSH) 代谢 (2.04%)、苯丙氨酸和酪氨酸及色氨酸的生物合成 (1.39%)、苯丙氨酸代谢 (1.14%)。在Cd胁迫下,Tor-1根系苯丙素合成与代谢和GSH代谢相关基因表达大部分显著上调,而GS合成相关基因表达受到抑制,并发生可变剪接事件,其中内含子保留事件发生最多。  【结论】  Tor-1根系在应对Cd胁迫时虽然根系形态受到一定损伤,但可通过增加抗氧化酶 (SOD、CAT) 活性减轻镉胁迫产生的危害,并积极通过调节苯丙素合成与代谢、GSH代谢以及抑制GS合成对应的基因来减轻Cd对植物的伤害,还可通过可变剪接来积极适应Cd胁迫。     

利用EST序列鉴定葡萄应答外源赤霉素的基因

为了利用NCBI上大量的葡萄(Vitis viniferaL.)EST序列进行葡萄应答外源赤霉素基因的信息挖掘,通过本地化Blast、Blast2go等工具以及其他生物信息学工具和数据库,对NCBI上经过赤霉素(gibberellins,GA)诱导后的葡萄EST序列进行处理,获得了45条仅在赤霉素处理后表达的无冗余EST序列。Blastx注释结果显示,45条序列中有25条序列注释为假定蛋白或未知蛋白(约占55.6%),14条序列无注释信息(约占31.1%),6条序列(13.1%)注释有推定功能,其中包括整合酶蛋白(EE077049)、SPX结构域基因1(EE085000)、丝氨酸羧肽酶类44蛋白(EE091188)、CHY1(EE092187)、假尿苷合酶/转运蛋白(EE106096)、钾离子通道蛋白(EE108944)。Blast2go分析显示,共有29条序列通过基因本体论(GO)注释180个GO号,分属于分子功能(molecula rfunction)、细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)三大类的不同水平。初步推断,在外源赤霉素对葡萄进行处理后,应答基因主要具有结合活性(46.34%)和催化活性(39.02%)两方面的分子功能。其作用空间分布为整个细胞(44.68%)或者细胞器(40.43%)中,并且主要通过参与细胞生理过程(28.57%)和代谢过程(25.71%)等一系列复杂的生理生化反应完成整个应答过程。为进一步研究赤霉素处理后导致葡萄的基因表达情况提供了基本资料。     

60Co-γ射线辐射水稻小RNA测序变异分析

为探讨γ射线辐射引起水稻损伤效应的小RNA变异,采用0、300和400 Gy的⁶⁰Co-γ射线辐射处理水稻高粳糯种子,利用Illumina HiSeq^TM 2500高通量测序平台对辐射后的高粳糯三叶期叶片进行小RNA测序。结果显示,0 Gy(对照)组共获得7 395 578个小RNA,254个已知miRNA成熟序列,26个新miRNA成熟序列;300 Gy剂量组(Gy3)共获得10 315 701个小RNA,265个已知miRNA成熟序列,29个新miRNA成熟序列;400 Gy剂量组(Gy4)共获得6 469 869个小RNA,261个已知miRNA成熟序列,29个新miRNA成熟序列。GO富集分析显示,Gy4 vs CK组差异miRNAs对应的候选基因富集到生物过程、细胞组分和分子功能三大类共58个小类,其中涉及分子功能的基因最多。Gy3 vs Gy4组差异miRNAs对应的候选基因富集到生物过程和分子功能两大类共7个小类,以离子结合、过渡金属离子结合和氧化还原酶活性占主要比例。KEGG富集分析显示前20条显著富集途径,Gy3 vs CK组差异miRNAs对应的候选基因富集到植物病原互作最高,富集最显著的是植物昼夜节律。Gy4 vs CK组差异miRNAs对应的候选基因组富集到代谢途径最高,富集最显著的是甘油磷脂代谢和醚脂类代谢,Gy3 vs Gy4组差异miRNAs对应的候选基因富集到甘油磷脂代谢、真核生物的核糖体发生和内吞作用三个途径最高,富集最显著的是醚脂类代谢。本研究从RNA水平为辐射诱变水稻引起当代的苗期损伤效应提供了新见解。     

突变型抑癌基因p53在蛋鸡J亚群禽白血病中的表达

摘要: 蛋鸡J亚群禽白血病是病毒引起的肿瘤性传染病。为了探讨J亚群禽白血病病毒的致癌分子机理, 观察蛋用型鸡发生J亚群禽白血病时p53抑癌基因在各脏器中的表达, 应用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化（SABC）法，研究了蛋用型鸡J亚群禽白血病自然病例的肝脏、肾脏、腺胃、肿瘤、输卵管、心脏、胰脏、骨髓、脾脏、肺脏、十二指肠、胸腺和法氏囊。结果表明：突变型p53在肝脏、肾脏、腺胃、肿瘤、输卵管中表达量最高，心脏、胰脏、骨髓、脾脏、肺脏、十二指肠、胸腺及法氏囊均可检出中等量的表达。这一结果提示突变型抑癌基因p53的表达参与蛋鸡J亚群禽白血病发生、发展过程。     

转GhB301基因棉花响应枯萎病菌侵染的转录组分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factor, ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制,本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系,通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理,抗病性鉴定结果表明,过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性,其病情指数为14.77,显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48 h后,利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析,共得到273 111 170个clean reads,其Q30均大于87.64%,将clean reads与陆地棉参考基因组TM-1比对,获得了14 021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比,转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程,67个DEGs参与防御反应,31个DEGs参与苯丙烷类生物合成,推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。     

Treatment of mcf-7 breast cancer cells with a red grape wine polyphenol fraction results in disruption of calcium homeostasis and cell cycle arrest causing selective cytotoxicity

Food components influence the physiology by modulating gene expression and biochemical pathways within the human body. The disease-preventive roles of several fruit and vegetable components have been related to such properties. Polyphenolic components such as flavonoids are strong antioxidants and induce the expression of several xenobiotic-detoxifying enzymes. The mechanism of selective cytotoxicity induced by red grape wine polyphenols against MCF-7 breast cancer cells was investigated in relation to their interference with calcium homeostasis. MCF-7 cells showed an increase in cytosolic calcium levels within 10 min of treatment with the polyphenols. Immunohistochemical localization of calmodulin with secondary gold-labeled antibodies showed similar levels of gold labeling in both MCF-7 cells and the spontaneously immortalized, normal MCF-10A cell line. MCF-7 cells treated with the red wine polyphenol fraction (RWPF) showed swelling of endoplasmic reticulum, dissolution of the nucleus, and loss of plasma membrane integrity as well as reduced mitochondrial membrane potential. These cells were arrested at the G2/M interphase. By contrast, MCF-10A cells did not show such changes after RWPF treatment. The results suggest that polyphenol-induced calcium release may disrupt mitochondrial function and cause membrane damage, resulting in selective cytotoxicity toward MCF-7 cells. This property could further be developed toward breast cancer prevention strategies either independently or in conjunction with conventional prevention therapies where a positive drug-nutrient interaction can be demonstrated.     

Seasonal variation of defense-related gene expression in leaves from Bois noir affected and recovered grapevines

Although Bois noir is one of the main phytoplasma diseases of grapevine, the gene expression and enzyme activities that underlie physiological changes occurring in symptomatic and recovered (with spontaneous or induced symptom remission) plants are mostly unknown. Bois noir symptomatic leaves (September 2006, 2007) and symptomless leaves from infected symptomatic plants (September 2007) of Sangiovese (moderately susceptible) and Chardonnay (highly susceptible) cultivars were collected. Moreover, leaves from infected symptomless plants of both cultivars were harvested in June 2007. Leaves from recovered plants were also collected in the same periods. In recovered plants of both cultivars, class III chitinase and almost every time phenylalanine ammonia-lyase and chalcone synthase expression were increased for all collection periods. In symptomatic leaves of both cultivars, the expressions of the same genes were up-regulated and also those of β-1,3-glucanase and flavanone 3-hydroxylase. The activities of chitinase, phenylalanine ammonia-lyase, β-1,3-glucanase, and superoxide dismutase generally correlated with gene expression. For the moderately susceptible Sangiovese, the defense genes were generally up-regulated in both symptomatic and symptomless leaves (for all collection periods). This behavior was not observed in the highly susceptible Chardonnay, in which changes in gene expression were linked to evident symptom display. Therefore, the physiological response of the plants to this pathogen infection appear to be the reason for the resistance of the cultivar to the disease.     

基于液滴微流控的壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测

为了建立基于液滴微流控芯片平台的植物免疫诱导剂的荧光信号检测技术,该文设计制作了具有液滴生成结构的芯片,制备包裹烟草(BY-2)细胞的液滴,并对包裹了细胞的液滴数目进行统计分析。将包裹细胞的液滴孵育一氧化氮探针后使用质量浓度为50μg/m L壳寡糖处理,在荧光显微镜下观测其产生的荧光,利用荧光酶标仪对比采用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势。结果显示,水相流速为100μL/h,油相流速为300μL/h时,微流控芯片产生的液滴尺寸适合包裹细胞,其中液滴包裹单细胞的比例达22.9%。经壳寡糖处理后的细胞在生成的液滴中产生了明显的荧光,且用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势一致。研究结果为开发基于液滴微流控技术的植物免疫诱导剂的高通量筛选平台提供参考。     

谷子SBP蛋白基因家族的鉴定及表达分析

为了深入分析SBP基因家族在谷子中的功能作用,本研究在谷子全基因组水平,通过NCBI blast及HMMER search等生物信息学方法进行了谷子SBP基因家族鉴定,分析了SBP蛋白理化性质及系统发育,利用RT-qPCR分析了谷子SBP基因在PEG和ABA胁迫下的表达情况。结果表明,谷子SBP基因家族有19个成员,位于9条染色体上,编码的氨基酸序列长度为199~1 118 aa。谷子SBP蛋白系统发育树结果显示,该蛋白家族可分为两大类:第一类分为六个亚类,第二类仅有一个SBP蛋白。谷子SBP蛋白家族成员的外显子数从2~11个不等,且均为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示,除SBP7外,所有的SBP蛋白在细胞核中均有信号。谷子SBP蛋白与拟南芥SBP蛋白在进化关系上较远,而与高粱、水稻SBP蛋白进化关系较近。谷子SBP基因家族启动子区域的顺式作用元件主要为植物激素、干旱、光照及病原菌、创伤类的响应元件。RT-qPCR分析结果显示,PEG和ABA胁迫诱导下,SBP基因在叶和茎中的表达均上调,表达量增幅表现为:叶>茎。PEG胁迫后SBP基因的表达增长量显著高于外源ABA诱导;其中,SiSBP13的表达量增幅最大,PEG胁迫4 h叶和茎中的表达量分别达到未胁迫时的180倍和15倍,ABA诱导4 h茎中的表达量最高达到未胁迫时的8倍,而叶中的表达量持续升高,24 h时达到未胁迫时的28倍。本研究为下一步深入研究SiSBPs基因在谷子生长发育阶段中的功能奠定了基础,也为谷子功能基因的挖掘利用提供了候选基因。     

基于RNA-seq的谷子萌芽期抗旱相关基因挖掘与分析

为了明确响应干旱胁迫的关键基因,解析谷子抗旱机制,本研究以谷子抗旱品种山西2010和干旱敏感品种K359*M4-1为材料,应用RNA-seq技术对两个品种干旱胁迫前后萌发期种子进行转录组测定。结果表明,在山西2010和K359*M4-1中分别鉴定出2 300个和3 652个差异表达基因(DEG),包括编码类锌诱导的促进因子、类萌发素蛋白、蛋白磷酸化酶、转运蛋白、胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)、转录因子、过氧化物酶等基因。通过对鉴定到的DEG进行GO和KEGG代谢途径富集分析,发现山西2010和K359*M4-1中的DEG分别富集在52个和21个生物学过程。KEGG 富集分析发现,DEG主要富集在淀粉和蔗糖代谢, 植物激素信号转导,光合作用-天线蛋白,苯丙素生物合成,角质、亚氨酸和蜡生物合成,次生代谢物生物合成等途径。本研究结果为挖掘谷子抗旱关键基因、解析谷子抗旱机制奠定了基础。     

植物防卫基因PvPGIP2和TaLTP4的克隆及其对小麦的转化

多聚半乳糖酸醛酶抑制蛋白和脂质转移酶蛋白是植物产生的防卫蛋白,对植物病原真菌具有防御作用。本研究利用同源基因克隆策略和RT-PCR技术,成功克隆了1个菜豆的多聚半乳糖酸醛酶抑制蛋白（PvPGIP2）编码基因和1个小麦的脂质转移蛋白（TaLTP4）编码基因;由于它们在功能上具有协同作用,我们以pAHC25为骨架构建了Pv...     

甲基营养型芽胞杆菌WM7低温响应转录谱分析

为从分子水平揭示甲基营养型芽胞杆菌WM7低温响应机制,采用高通量测序技术对低温和常温培养的菌体进行转录组测序分析,对部分差异表达显著基因进行RT-qPCR验证。结果表明,共检测到2 029个差异表达基因,其中1 519个低温上调,510个低温下调。GO和KEGG分析显示,1 199个差异表达基因归属细胞组分、分子功能和生物过程3个部分,683个基因参与到225个代谢途径中,其中涉及基因最多的是磷酸戊糖途径、嘌呤和氨基酸合成途径。菌株低温响应主要与脂肪酸代谢、ABC转运体、转录调控、信号转导、碳氮代谢等途径相关。此外,检测到大量差异表达的未知功能基因,多个基因差异表达倍数均大于50倍。本研究从基因表达方面阐述了甲基营养型芽胞杆菌WM7低温响应机制,为全面揭示其低温生长机制奠定了理论基础,提供了基因信息。