RHDVCD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDVCD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDVVP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％,与其它毒株的同源性在92．0％～96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi—co-89株同源性最高为99．4％,与其它毒株的同源性在96．6％N98-3％之间。     

兔出血症病毒CD株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆、核酸及氨基酸序列比较分析

以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了序列测定 ,测序结果表明 ,CD株 VP6 0基因全长 174 0 bp。该序列与已发表的其他分布于世界各地的 14株 RHDV序列进行了比较和基因进化树分析。无毒株与各强毒株之间的同源性为 85 .3%～86 .5 % ,强毒株间的同源性较高 ,为 92 .1%～ 10 0 %。根据进化树可把强毒株分为 2大群 ,一群为 CD株、Iowa2 0 0 0株、0 0 - 139株、99- 0 5株 ,其余的为另一群。进一步细分 ,还可以分为 4个亚群和 7个组。但毒株之间的地域性差异并不明显。同时根据 15株 RHDV VP6 0基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列 ,并进行氨基酸序列的比较和亲水性、柔性区、抗原性和表面结构的比较分析。结果显示 ,各毒株氨基酸之间的的同源性在 90 .5 %～ 10 0 %之间 ,其中无毒株与各强毒株之间的同源性为 90 .5 %～ 91.9% ,强毒株间的同源性在 95 %～ 10 0 %之间 ;氨基酸变异分析未发现突变造成的 VP6 0蛋白高级结构的根本性变化     

兔出血症病毒RC株VP60基因扩增与序列分析

本实验应用RT—PCR方法从兔出血症病毒荣昌分离株（RHDV—RC）中扩增出衣壳蛋白VP60基因并测序,从GenBank下载已发表的16株RHDVVP60序列,运用生物信息学软件分析并构建系统进化树和氨基酸序列同源性表。结果表明。RC株的VP60基因大小为506bp,GC含量为56．35％．与其它16株RHDVVP60基因核苷酸序列的同源性较高,最高达98.2％;而氨基酸序列的同源性达80％左右。     

兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析

应用RT-PCR方法从兔出血症病毒（RHDV）西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册（登录号为DQ530363）。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区（西北、华东、东北、西南）的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。     

兔出血症病毒JL株分离鉴定及VP60基因主要抗原表位分析

采用血凝试验、电镜观察、RT－PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒（RHDV）,扩增衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMDl8－T载体上,经酶切鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1740bp,编码580个氨基酸;JL株与其他RHDV分离株比较,核苷酸同源性为93．7％－99．2％,氨基酸同源性在97．3％－99．5％,在VP606个区中,A、B、D、F是稳定区,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;将JL株与国内外标准株蛋白氨基酸变畀及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行比较分析,预测RHDV VP60细胞表位。     

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析.     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV(AV33)抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株(RHDVa),与RHDV1和RHDV2VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%～97.6%和81.1%～81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%～98.3%和87.4%～87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD₅₀测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD₅₀为10^-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。     

一株兔瘟病毒野毒株的分离与鉴定

为了对南部县某兔场疑似兔出血症病毒(RHDV)NB毒株进行鉴定,试验采用血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验、家兔接种试验、家兔免疫攻毒试验、VP60基因的同源性比对。结果显示:NB毒株能凝集人"O"型红细胞,HA效价为12 log2,其血凝性能被RHDV疫苗毒株AV33株的抗血清抑制;NB毒株注射健康非免家兔,家兔在48h内死亡,具有典型的兔病毒性出血症(RHD)的临床症状和病理变化;RHDV(AV33)组织灭活疫苗免疫家兔后,家兔能抵抗NB毒株的攻击;NB毒株与AV33毒株的VP60基因同源性为96.12%,氨基酸序列同源性为97.59%。     

阿留申病毒强致病性毒株非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据Genbank公布的全基因序列设计两对引物,利用PCR扩增技术,得到阿留申病毒非结构蛋白基因ADV-LN1、ADV-LN2,将其克隆至pMD18-T载体中进行序列测定,并与其它国内外毒株的非结构蛋白进行序列比较和分析。序列分析表明,同国外毒株相比核苷酸序列同源率NS1为87.8%～99.1%,NS2为87.7%～98.5%,NS3为85.4%～99.2%;氨基酸序列同源率NS1为82.5%～98.0%,NS2为81.6%～96.5%,NS3为78.2%～98.9%;与国内毒株相比核苷酸序列同源率NS1为91.5%～93.8%,NS2为93.0%～94.7%,NS3为93.5%～96.6%;氨基酸序列同源率NS1为87.4%～89.9%,NS2为87.7%～90.4%,NS3为88.5%～94.3%。系统进化树分析表明:国内流行毒株之间与欧美毒株之间,差异逐渐缩小,遗传变异趋势更加复杂。     

山西猪瘟野毒株E_2基因序列测定与遗传变异多样性分析

为了解山西地区猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法,2013年从山西部分地区分离出5株CSFV流行毒株,并进行了E2全基因扩增、克隆与序列测定,应用DNAStar分析软件对所测定的5株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析,绘制系统发育进化树。结果表明：5株CSFV流行毒株之间E2基因核苷酸序列与所推导氨基酸序列的同源性分别为81.4%~100%和87.9%~100%,与CSFV石门毒株（Shimen株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为82.9%~94.8%和89.0%~94.9%,与CSFV兔化弱毒株（HCLV株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.6%~99.6%和87.9%~99.5%,与17株来自各国不同地区的CSFV参考毒株的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.5%~99.6%和86.3%~99.7%。经系统发育关系分析,4株属于基因2群,且705、713、725、729、734和738位氨基酸发生置换,另外1株属于基因1群。本研究揭示了山西猪瘟流行毒株的遗传变异多样性现状。     

兔出血症病毒(RHDV)全基因组克隆与分子流行病学分析

根据GenBank已发表的多株RHDV全基因组序列，设计3对扩增RHDVCD株的特异性引物，扩增了RHDV CD株包含全序列的3个片段，并分别克隆到pMD18-T载体上。根据引物上唯一的交叉酶切位点，把三个克隆片段同时克隆到pUC18载体上，获得了RHDV CD株全基因组克隆，测定了全基因组序列（GenBank accession number AY523410）。进行了CD株全序列与GenBank上已发布的其他6株全序列比较及基因进化树分析。发现除CD株外，其余6株（西班牙AST-89株、法国SD株、意大利BS89株、德国分离1株、德国分离2株、澳大利亚Czech V351株）之间的同源性均很高，在93．9％～100％之间，而CD株与其他6株之间的同源性均较低，在89．0％～89．6％之间。德国的2个分离株序列完全相同，应为同一毒株：进化树分析表明，此7株病毒可形成2个明显的分支，中国CD株形成一个分支，其余欧洲、澳大利亚分离株开成一个分支，具有明显地域差异特征．     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

我国近期7株猪瘟流行野毒E2基因变异研究

应用RT PCR 和nPCR 扩增了7 株国内近期(2001 年-2003 年)流行的猪瘟野毒E2 基因,分别克隆至pGEM T 载体并对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与C 株、Alfort 株、Brecsia 株进行了同源性比较及遗传进化分析,构建了CS FV的遗传发生树,并对E2 结构与功能进行了分析。所测7株野毒均包括完整的信号肽序列及部分跨膜区在内的1 170 bp,与C株、Alfort株、Brescia 株核苷酸序列同源性分别为91.6%~94.5%、89.2%~92.7%、85.9%~89.3%,氨基酸同源性分别为91.2%~95.8%、88.9%~92.0%、84.0%~90.1%;而7株野毒之间的差异很小,其核苷酸序列同源性为95.8%~99.7%,氨基酸同源性为96.3%~99. 1%。所绘制的遗传发生树分为2个组群,所测得7 株流行野毒均属于第1 群,而且可分为两亚群,与C 株在同一亚群。同时对主要抗原区氨基酸位点变异进行了分析,对其抗原决定簇的变异情况进行了推测。     

长角血蜱甘肃株肌钙蛋白基因P27/30的克隆和序列分析

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株肌钙蛋白P27/30基因的核苷酸序列,设计合成一对引物,从本实验室保藏的干净长角血蜱卵中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出607 bp的肌钙蛋白基因,将其克隆于PGEM-T-Easy载体,对其进行序列分析,并推导出氨基酸序列,将这一序列与国内外已发表的长角血蜱肌钙蛋白基因进行比较分析。结果表明本实验室保藏的长角血蜱甘肃株与上述已发表的Okayama株核苷酸序列同源性为92.1%,氨基酸同源性为86%。长角血蜱甘肃株与Okayama株、四川孤雌生殖株的发育有一定差异。经RT-PCR分析表明,该基因在长角血蜱的卵、幼蜱、若蜱和饥饿成蜱这几个阶段均有表达。     

欧洲型PRRSV RT-PCR检测方法的建立及ORF7基因序列比较

根据PRRSV(LV株)ORF7基因设计一对引物,建立了欧洲型PRRSV的RT-PCR检测方法.通过对50份组织病料检测及其ORF7基因序列分析,结果表明,有4份组织病料扩增出欧洲型PRRSV 576bp特异性片段,阳性率为8%,其ORF7基因序列和氨基酸推导序列与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株(AMERVAC-PRRS)的同源性分别在99.0%～99.7%和98.5%～100%之间,而与标准毒株(LV)的同源性分别在95.9%～96.6%和96.9%～97.7%之间.表明该PT-PCR体系适合组织病料中欧洲型PRRSV的直接检测,同时也证实了欧洲型PRRSV在我国的存在,并且与疫苗株之间具有较高的同源性.