苹果蔗糖转运蛋白基因的生物信息学分析

蔗糖是绿色植物光合作用产物储存、转运的重要形式,而蔗糖转运蛋白在蔗糖的长距离运输过程中起关键作用。以苹果蔗糖转运蛋白为研究对象,首先从苹果基因组中筛选获得苹果蔗糖转运蛋白的基因序列,利用生物信息学软件预测其蛋白相对分子质量、结构域、跨膜区和糖基化修饰位点等分子特征,并对其进行系统发育分析。结果表明,苹果基因组中含有6条cDNA全长序列,cDNA长度范围是1 667～2 635 bp,包含11～12个跨膜结构域,分别属于SUT1,SUT2和SUT4家族。研究结果将为利用蔗糖转运蛋白基因进行苹果分子育种和优良品种选育提供有益信息。     

玉米ZmSUT4基因RNAi植物表达载体的构建

蔗糖转运蛋白(sucrose transporters,SUCs或SUTs)是蔗糖装载、卸载、分配的重要载体,Zm SUT4是玉米低亲和、高转运能力SUT4亚族的唯一成员。以黄早四Zm SUT4全长c DNA序列为模板,设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,PCR扩增获得正向、反向2个片段,将反向、正向片段双酶切后依次插入p Green-HY104植物表达载体中,从而构建由35S启动子调控的Zm SUT4基因RNA干扰(RNAi)的植物表达载体HY104-A-S,然后通过冻融法将载体质粒转入含有p Soup质粒的农杆菌EHA105中。Zm SUT4基因RNAi的植物表达载体的构建为研究Zm SUT4基因的功能奠定了基础。     

玉米ZmSUT4-J基因的克隆与植物表达载体构建

植物蔗糖转运蛋白负责蔗糖的跨膜运输,在韧皮部介导的源-库蔗糖运输以及库组织的蔗糖供给中起关键作用。本研究利用RT-PCR方法,从玉米自交系吉853中获得位于3号染色体上蔗糖转运蛋白(SUT4)的基因,命名为ZmSUT4-J,测序结果表明开放阅读框(ORF)1506bp,编码501个氨基酸,利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、结构和功能进行了分析和预测;并借助荧光定量RT-PCR方法对ZmSUT4的组织表达特异性进行了分析。同时为了验证其生物学功能,构建了适合玉米遗传转化的表达载体,为进一步利用ZmSUT4基因开展玉米高产转基因育种的研究工作奠定了基础。     

杉木磷转运蛋白ClPht1;2基因克隆与表达特性分析

磷酸转运蛋白PHT1家族是介导植物磷素吸收与转运分配的重要基因家族。从第3代杉木优良无性系洋061中克隆获得1个杉木磷转运蛋白ClPht1;2，并对不同程度磷胁迫下ClPht1;2的时空表达进行分析，为了解杉木磷转运蛋白基因结构和功能表达奠定基础。以转录组测序获得的ClPht1;2核心序列为基础，以杉木洋061无性系根系cDNA克隆为模板，利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆目的基因的全长，采用实时荧光定量PCR技术，检测了杉木洋061无性系在不同组织中ClPht1;2的表达，以及磷饥饿诱导3、10、25 d下ClPht1;2在根中的表达量变化。克隆得到1个杉木PHT1家族基因ClPht1;2（GeneBank登录号:MK450598）。ClPht1;2编码氨基酸序列与日本柳杉磷转运蛋白家族基因编码氨基酸序列相似性为93%，与马尾松、油茶、毛果杨等植物磷转运蛋白家族基因的编码氨基酸序列比对，结果相似性均>72%。ClPht1;2基因序列编码区长1 565 bp，编码511个氨基酸，蛋白理论分子量60.024 ku，为疏水蛋白，不具有信号肽，潜在磷酸化位点42个。ClPht1;2所编码蛋白质由12个跨膜结构组成，其中11个为确定跨膜域，多肽链中α螺旋占42.65%，无规则卷曲占42.11%，延伸链占15.25%。ClPht1;2在杉木洋061无性系的根、茎、叶中均有表达，在叶片中的表达量最高，在根中的表达量最低。与正常磷供应相比，根系ClPht1;2的表达水平在低磷胁迫10 d时显著增加，到25 d时下降至正常磷供应时的表达水平；ClPht1;2在无磷胁迫处理3 d时表达量降低，在10 d时表达量显著提高，在25 d时表达量又低于正常供磷水平。ClPht1;2基因具有PHT1基因家族特征结构，在杉木不同组织中均有表达，在杉木根中的表达受低磷胁迫诱导，在叶中的表达量受低磷胁迫诱导不明显，可能为杉木体内低亲和的磷转运蛋白，参与杉木地上部和根中磷的运输和分配。     

甘蔗蔗糖转运蛋白SoSUT5基因克隆、表达及功能鉴定

[目的]克隆甘蔗蔗糖转运蛋白基因SoSUT5,分析其表达特性,并通过转化酵母突变体验证其功能,为研究SUT5基因的功能提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖28(GT28)未成熟茎cDNA为模板,采用RT-PCR从甘蔗中克隆SoSUT5基因,并进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SoSUT5基因在甘蔗不同组织的表达情况,同时构建酵母表达载体并转化酵母突变体SUSY7/ura3进行基因功能验证.[结果]克隆获得的SoSUT5基因为1605 bp,编码534个氨基酸,GenBank登录号KF808328.SoSUT5蛋白的分子量和理论等电点(pI)分别为56.40 kD和8.36,具有12个跨膜结构,属于易化扩散载体(MFS)家族成员,也属于蔗糖/H+共转运体家族(GPH)成员.该蛋白具有保守的SUT蛋白功能域,是SUT5亚家族成员.在甘蔗生理成熟期,从成熟茎、花序、成熟芽和根中均能检测到SoSUT5基因表达,以在花序中的表达量最高,根次之,但在+1叶中检测不到.转pDR196空载体的酵母突变体SUSY7/ura3在以蔗糖为唯一碳源的MD培养基上不能生长,但转pDR-SoSUT5重组质粒的酵母突变体SUSY7/ura3能正常生长,说明SoSUT5蛋白具有蔗糖转运活性.[结论]SoSUT5基因编码蛋白具有转运蔗糖的生物学功能,在甘蔗蔗糖运输和积累过程中发挥调控作用.     

蔗糖转运蛋白OsSUT5在水稻花粉发育及结实中的作用

【目的】蔗糖是植物体内光合产物运输的主要形式。蔗糖-质子同向运输蛋白（sucrose transporter/sucrose carrier,SUT/SUC）在植物细胞之间的蔗糖跨膜运输以及植物组织和器官之间的蔗糖分配中具有重要作用。水稻SUT家族共有5个成员。已有研究表明,敲除OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4对水稻的生长发育产生显著影响,说明这些基因不可替代。然而,OsSUT5的功能还未见报道。阐明OsSUT5在水稻生长发育中的作用,将为全面了解SUT蛋白在模式植物水稻中的生理功能提供新的依据。【方法】通过对水稻OsSUT5的时空表达特性进行实时荧光定量PCR分析,同时利用OsSUT5的推测启动子驱动GUS在水稻体内表达,获得其基因编码蛋白的组织定位信息,以及在烟草叶片表皮细胞内进行OsSUT5-GFP融合蛋白瞬时表达,对蛋白进行亚细胞定位,比较基因编辑技术（CRISPR-Cas9）创制的OsSUT5不同纯合突变株系与野生型对照水稻的形态和生理特征,获得OsSUT5的功能信息。【结果】转录水平上,OsSUT5在水稻茎、叶、花序和颖果中均有表达,并且该基因编码蛋白在营养器官中的表达集中于维管组织。在生殖器官中,OsSUT5的表达主要位于花药及发育的颖果内。该基因编码蛋白在水稻发育的颖果特别是盾片和胚根鞘中高表达。烟草叶片表皮细胞内的瞬时表达显示OsSUT5-GFP融合蛋白定位于细胞质膜。与野生型水稻相比,3个OsSUT5纯合突变株系均表现为花粉活性以及离体萌发率明显降低。与此相吻合的是,OsSUT5突变株系未授粉的小穗比例相对于野生型显著增加,同时突变株系结实率显著下降。通过对OsSUT5突变株系颖果的观察和比较显示,OsSUT5突变体水稻颖果的垩白相对于野生型明显增多,其颖果长度相对于野生型对照也有一定程度的增加,但统计结果表明OsSUT5突变体水稻的千粒重与野生型无显著区别。【结论】OsSUT5在水稻花粉发育甚至受精过程中可能发挥重要作用;敲除OsSUT5对水稻的结实率、籽粒的形态和品质有明显影响。推断OsSUT5在水稻开花结实中的作用（包括对花粉活性和颖果内胚乳发育的影响）与其蔗糖运输功能密切相关。     

质子对植物蔗糖转运蛋白和己糖转运蛋白活性的调节

蔗糖是植物体内进行长距离运输的主要营养物质和信号分子。蔗糖转运蛋白和己糖转运蛋白是蔗糖从源到库的运输过程中的重要参与者。质子不仅通过形成质子动子势为蔗糖和己糖逆浓度梯度跨膜转运提供动力,还调节它们的活性,从而影响蔗糖的运输和分配。该文总结了质子对蔗糖转运蛋白的调节和质子对己糖转运蛋白活性及功能的调节,并加以展望。     

甘蔗蔗糖转运蛋白SoSUT2基因克隆和表达分析

为分析甘蔗SUT家族基因新成员的序列特征和基因表达模式,采用cDNA末端快速克隆技术,以甘蔗GT28未成熟茎cDNA为模板克隆蔗糖转运蛋白基因,命名为SoSUT2-h1,GenBank登录号KF808330。该基因的cDNA序列全长为2 132bp,开放阅读框长1 749bp,编码582个氨基酸,预测分子量和等电点分别为61.80ku和6.17。SoSUT2-h1蛋白具有12个跨膜结构。该蛋白具有保守的蔗糖转运蛋白功能域,属于MFS蛋白家族和GPH(蔗糖/H+共转运体)超家族中的一员。荧光定量PCR表明在甘蔗叶、花序、芽、茎和根中都能检测到SoSUT2基因表达,其中在芽中表达量最高,花序次之,而在根中表达量最低。在甘蔗工艺成熟期,SoSUT2基因表达量与节间蔗糖含量呈正相关性,推测该基因可能参与调控甘蔗节间蔗糖的积累。     

苦荞蔗糖转运体家族FtSUCs的鉴定与生物信息学分析

植物蔗糖转运体家族蛋白( sucrose transporter, SUC)是介导蔗糖跨膜运输的重要载体。本文基于苦荞幼苗发育过程中转录组测序获得的数据库,筛选鉴定到10个FtSUCs基因,序列长度在1 436~7 109 bp,编码氨基酸148~605个,其中8个FtSUCs可能定位于内质网,其序列一致性为34.30%,保守位点达到20个。苦荞FtSUCs与拟南芥AtSUCs基因被聚为3类,FtSUCs中4个归入类型Ⅰ,2个归入类型Ⅱ,4个归入类型Ⅲ。苦荞FtSUCs蛋白主要由α-螺旋、不规则卷曲、延长链与β-折叠组成,其中9个FtSUCs包含跨膜结构域。幼苗发育过程中,FtSUCs基因间表达模式存在差异,其中,FtPinG0002608200.01、FtPinG0001943900.01、FtPinG0001944100.01在子叶期高表达,FtPinG0000342600.01表达量逐渐提高,FtPinG0001943500.01和FtPinG0009584000.01在各时期稳定表达,推测它们可能在不同发育阶段发挥特定功能。苦荞中多个FtSUCs基因存在显著正相关或负相关关系,暗示FtSUCs基因间可能存在协同效应或功能互补,进而共同调控蔗糖的跨膜运输。     

甜高粱蔗糖转运蛋白SUT1基因表达载体的构建及转化农杆菌

为了获得甜高粱蔗糖转运蛋白SUT1基因的植物表达载体。采用PCR方法对甜高粱SUT1基因全长c DNA开放阅读框进行扩增,并将其与植物表达载体UBI-1300-GFP进行连接,连接后转化农杆菌EHA105。实验结果表明,成功克隆了SUT1基因开放阅读框,并将含有目的基因的重组表达载体转化到了农杆菌中。这将为进一步研究甜高粱SUT1基因的功能具有重要意义。     

甘蓝型油菜籽粒RNA提取方法的探讨

用CTAB法、SDS法、上海华瞬植物叶RNA抽提试剂盒分别提取甘蓝型油菜花后40 d的籽粒RNA.用电泳法和A260/A280与A260/A280的比值比较提取RNA的质量.结果发现:用SDS法、上海华瞬植物叶RNA抽提试剂盒都没有成功提取RNA,只有CTAB法成功地提取出了完整的甘蓝型油菜籽粒RNA.用CTAB法提取的总RNA的A260/A230与A260/A280的值分别为2.06和1.94,说明采用该方法提取的RNA污染小,纯度较高,获得的RNA产量也较高.通过逆转录实验和基因片段的克隆也证明获得的RNA质量比较高,可以直接满足一般的分子实验.     

杉木林取代杂木林后林分水源涵养功能差异的研究

采用固定标准地法,对南平溪后70年生杉木丰产林（山坡、山洼和32年“青年林”（山坡）及杉木林的前身杂木林的水源涵养功能进行了为时两年的研究,结果表明:杂木林林褥层的饱和持水量分别是杉木“青年林”和丰产林（山坡和山洼）的5.3倍、3.3倍和6.5倍,杂木林土壤层（10～40cm）饱和持水量分别比“青年林”和丰产林（山坡和山洼）高14.94％、13.81％和17.15％。杂木林林分总持水量分别比“青年林”和丰产林（山坡和山洼）高15.06％、13.73％和16.40％。杂木林表层（10～20cm）土壤初渗值和稳渗值分别是“青年林”和丰产林（山坡和山洼）的1.16倍、2.32倍和1.78倍。杉木林取代杂木林后林分水源涵养的功能下降,地上部分各水文层的持水作用随时间发生转移,表明其水源涵养功能的不稳定性。     

杉木不同无性系组培苗生根技术研究

以福建省洋口国有林场选育的3个杉木优良无性系“洋6421#”、“洋062#”和“洋243#”为材料,研究其组培苗瓶内瓶外生根技术。结果显示：杉木3个优良无性系组培苗的最佳瓶内生根培养基为：1/4改良MS＋IBA（0.3mg/L）＋NAA（0.2mg/L）＋蔗糖（2%）,接种30d后生根率都可达91%以上;瓶外扦插生根需要的最佳激素及其浓度为0.3mg/L的IBA,扦插45d后生根率都可达89.7%以上。     

白菜总RNA的高效提取方法及常见问题分析

[目的]建立从白菜叶片组织中快速提取高质量RNA的方法,为进行LD—PCR、AnP、SRAP及其他分子生物学试验奠定基础。[方法]通过增加高速离心时间,用3％H2O2处理试验器皿等措施对Trizol试剂法进行优化,建立了一种简单、快捷、经济、高效的RNA提取方法。[结果]在1．5h左右可得到高质量的总RNA,经琼脂糖凝胶电泳、蛋白核酸分析仪检测,提取的总RNA具有清晰的28S、18S、5S3条带,且28S的宽度是18S的2倍左右,0D260／DD280比值为1．90—2．16。进一步以提取的总RNA为模板成功进行了单链cDNA的合成和LD—PCR。[结论]改良的Trizol试剂法所提取的RNA纯度和完整度极高,可用于LD—PCR、SRAP、基因克隆及表达分析等后续分子生物学试验。     

一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建

为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的p GWB506载体,构建植物过表达载体p GWB506-35S-ClCesA-GFP.     

杉木纯林土壤性质与林下植被的通径分析1）

以闽西北地区不同林龄的杉木人工纯林为研究对象,对林地土壤的理化性质、林下植被生物多样性和生物量进行通径分析。结果表明：（1）随着土层深度的加深和杉木纯林林龄的增长,土壤密度逐渐增大,土壤总孔隙度和土壤含水率逐渐减小,毛管孔隙度无明显变化。（2）随着林龄的增加,全钾、全氮、全磷质量分数呈逐渐增加趋势,速效钾、速效磷、有机质、铝和锌的质量分数先减少后增加。（3）随土层的加深,土壤中速效钾、碱解氮、速效磷、全氮和有机质的质量分数逐渐减少,铝、铁和镁元素的质量分数则逐渐增加。（4）随着林龄的增加,灌木的Shannon－Wiener指数先减小后增大,生物量逐渐增大;草本的Shannon－Wiener指数和生物量均先增大后减小。（5）土壤物理性质对灌木生物量和草本生物量有较大的影响;土壤中速效钾、全钾、全磷、铁和锌对林下植被多样性和生物量均有显著影响（ P＜0．05）。     

桑黄总RNA提取方法研究

为探索适合桑黄总RNA的提取方法,以桑黄菌丝体为试验材料,比较了用Trizol法、CTAB法和RNA prep pure Plant Kit试剂盒法提取后总RNA的质量。结果表明,3种方法均能从桑黄菌丝体中提取分离到总RNA,其中 Trizol 法能提取到纯度较高、完整性较好的总RNA,28S及18S带型清晰无弥散,A260/A280值为196,RNA 产率为60464 μg·g-1,提取的总 RNA 适用于基因克隆与基因表达分析等分子生物学试验研究。     

Trizol试剂法快速高效提取3种作物不同组织总RNA

[目的]建立适用于禾本科作物不同组织总RNA的快速、高效提取方法,为进行后续的分子生物学研究奠定基础.[方法]采用Trizol试剂法,通过改变抽提上清液吸取量、沉淀方法及沉淀漂洗次数,对甘蔗、玉米和水稻的叶片、茎尖和根尖的总RNA提取方法进行优化.[结果]与吸取0.4 mL上清液相比,吸取0.2 mL上清液的总RNA OD260/OD280、OD260/OD230值分别在1.95~2.00和2.11~2.44,所获得的总RNA纯度较高.沉淀漂洗两次的OD260/OD230值(2.11~2.47)明显高于沉淀漂洗1次的总RNA OD260/OD230值(1.01~1.61),总RNA纯度较高.经异丙醇沉淀所得的各材料的总RNA 28S、18S和5S谱带清晰,无拖尾现象,总RNA完整性较好;LiCl沉淀法的RNA条带较模糊粘连,5S条带明显弥散,总RNA产率相对较低.以Trizol-异丙醇法提取的甘蔗总RNA为模板进行GAPDH基因片段扩增,所获甘蔗的叶片、茎尖和根尖的GAPDH基因表达丰度很强,无特异扩增,目的片段长度为153bp.[结论]改良Trizol-异丙醇法提取甘蔗、玉米和水稻不同组织的总RNA带型清晰、完整性好、纯度和产率高,适用于快速、高效提取禾本科植物不同组织总RNA.