鲤疱疹病毒3型研究进展

正鲤鱼是人类最廉价的优质蛋白获取源之一,提升鲤鱼产量可以在一定程度上解决全球粮食问题。锦鲤色彩艳丽、身姿矫健,是观赏鱼中的佼佼者,备受世界宠物爱好者的喜爱。锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease,KHVD)是会使鲤鱼、锦鲤及其变种大量死亡的疾病,大面积暴发该病时死亡率为80%~100%,因其较高的发病率和死亡率广受世界关注。一、病原体锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)又称为鲤科疱疹病毒3型(Cy HV-3),是KHVD的致病源。KHV来     

锦鲤疱疹病毒病的防治方法

<正>锦鲤疱疹病毒病是一种可感染各个年龄段鲤科鱼类(以锦鲤和鲤为主)的全球性疫病。2008年农业部公告第125号将其列为二类动物疫病，其病原为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)^[1]。近几年，由于进出口国际贸易的发展，锦鲤疱疹病毒病在世界范围内广泛传播，对鲤和锦鲤的养殖产生严重困扰，威胁产业健康发展。我国是渔业大国，     

锦鲤疱疹病毒病的诊断和治疗

<正>锦鲤疱疹病毒病(Koi hepesvirus disease,简称KHVD)是由疱疹病毒(KHV)引起的一种传染性疾病。目前的流行病学研究表明,该病毒仅感染鲤和锦鲤,不论鱼苗、幼鱼还是成鱼,都会感染KHV,死亡率高达80%～100%。     

锦鲤疱疹病毒病的诊断和应对措施

锦鲤疱疹病毒病(Koi hepesvirus disease,简称KHVD)是由疱疹病毒(KHV)引起的一种传染性疾病。目前的流行病学研究表明,该病毒仅感染鲤和锦鲤,不论鱼苗、幼鱼、还是成鱼,都会感染KHV,死亡率高达80%～100%。     

锦鲤疱疹病毒3型ORF126基因克隆及生物信息学分析

为研究锦鲤疱疹病毒3型(KHV-3)ORF126基因编码蛋白的功能,我们对该蛋白的结构特征进行研究分析。本实验采用PCR扩增技术获得KHV ORF126基因的完整序列,构建pMD19-T-ORF 126重组质粒,应用生物信息学方法分析ORF126基因编码蛋白的理化特征。结果显示:KHV ORF126基因翻译合成273个氨基酸;ExPasy预测该蛋白的理论分子量为29.9kDa,等电点为5.11;信号肽的切割部位最可能位于第19~20位氨基酸之间;跨膜区位于第145~168位氨基酸;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白不含N-糖基化位点,含有4个O-糖基化位点和17个磷酸化位点。     

白山市鸭绿江网箱养鲤冰下爆发锦鲤疱疹病毒病的鉴定

锦鲤疱疹病毒病(Kio herpesvirus disease,KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)引起的鲤(Cyprinus carpio L)、锦鲤、框镜鲤的一种高传染率和致死率的疾病,发病季节多为春秋季,常发水温为18~28℃。2015年3月初,低温条件下,吉林省白山市鸭绿江某网箱养殖场鲤鱼大量死亡,其因不明。本实验采用PCR方法进行鉴定,对其编码的膜糖蛋白基因ORF25和囊膜蛋白ORF81基因进行检测,测序结果显示该病毒的目的基因片段与KHV-cj同源性达96%。综上所述,可判定该养殖场鲤爆发的疾病为锦鲤疱疹病毒病。目前该病在低温下爆发的报道还比较少,因此本实验为锦鲤疱疹病毒病爆发的温度条件提供了参考,同时也为该病的防治提出了一些措施及建议。     

锦鲤疱疹病毒研究进展

<正>锦鲤疱疹病毒病(Koi Herpesvirus Diease,KHVD),为疱疹病原科,鲤疱疹病毒属,是由锦鲤疱疹病毒(Koi 540Herpesvirus, KHV)所诱发的一种致死率高达80～100%的流行性疾病。主要感染鲤鱼,如锦鲤以及其他变异鲤科鱼类。首次发现于1998年,由德国和以色列学者从患病的鲤鱼和锦鲤中分离,并被得到证实的一种病毒。国内2001年于香港发生首例疱疹病毒爆发事件,随后在东南亚许多国家的也     

锦鲤疱疹病春主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白(KHV-MEP)的功能及锦鲤疱疹病毒(KHV)的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤(Cyprinus carpio Koi)肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段.将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件Tmpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2.所获得的基因片段大小为771 bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因(AB178537)的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点(PI)为8.65.该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇.结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因.     

鲤疱疹病毒3型ORF148 DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P0.01)。本研究旨在为CyHV-3 DNA疫苗的应用提供理论依据。     

锦鲤疱疹病毒CJ株ORF27基因克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF27基因编码蛋白的结构特征和进化关系,采用镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF27基因,将其克隆在pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF27基因的结构和功能,并与GenBank上公布的三株KHV构建系统进化树。结果显示：获得207bp的ORF27基因,编码69个氨基酸;预测ORF27编码蛋白的理论分子质量为7366.62Da,等电点为4.487;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白存在1个N-糖基化位点、4个O糖基化位点和5个磷酸化位点;系统进化树分析表明与锦鲤疱疹病毒美国株（KHV-U）属同一分支。     

锦鲤疱疹病毒病

<正>锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease,KHVD)是20世纪末被确定的一种疾病,现已流行于世界各地,是严重威胁鲤和锦鲤养殖业安全的一种疾病,世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的疾病,我国将其列为二类疫病。一、病原学病原是锦鲤疱疹病毒(K o i herpes virus,KHV),暂列为疱疹病毒科(Herpesviridae),鲤疱疹病毒属(Cyprinid herpesvirus),又称鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyHV-Ⅲ),与鲤痘疮病毒(鲤疱疹病毒Ⅰ型,CyHV-Ⅰ)和金鱼造血器官坏死病毒(鲤疱疹病毒Ⅱ型,CyHV-Ⅱ)同属。KHV和CyHV-Ⅰ存在交叉的抗原反应。KHV是球状病毒,成熟病毒颗粒有囊膜,直径约170nm～230nm。核衣壳为对称十面体,直径100nm～110nm,由31种病毒多肽组成,其中21种多肽分子量与鲤疱疹病毒相似,10种多肽与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)相似。KHV含有双链DNA,基因组大小约为277kb,比疱疹病毒科的其他病毒基因组(250kb)大。二、流行病学目前该病流行范围已遍及欧亚美非各大洲的以色列、英国、德国、美国、南非、日本、韩国、中国、马来西亚、新加坡、印度尼西亚等国家,并在部分国家造成危害。1998年5月,该病在以色列首次发生,随后18个月内连续发生三次,造成以色列600吨食用普通鲤和400万美元出口锦鲤的损失。使以色列鲤和锦鲤养殖业遭受毁灭性打击。2002年4月印度尼西亚养殖锦鲤和鲤暴发该病,损失500万美元。2003年10月日本10余个县暴发该病,造成近千吨的鲤和锦鲤死亡。KHV的严重危害引起国际动物卫生组织(OIE)和世界粮农组织(FAO)的高度关注。KHV仅仅感染锦鲤、鲤和剃刀鱼(Solenostomus paradoxus)。其鱼苗、幼鱼、成鱼,均可感染。KHV发病最适温度是23℃～28℃(低于18℃,高于30℃不会引起死亡)。若鱼已感染KHV,水温18℃～27℃间持续时间越长,疾病暴发的可能性越大。该病多发于春、秋季,潜伏期14天,鱼发病并出现症状24小时～48小时后开始死亡,开始死亡至2天～4天内死亡率可迅速达80%～100%。KHV暴发后幸存的鱼成为疾病的传播者,可将病毒传染给其他健康的鱼。KHV主要通过水平传播,能否垂直传播目前尚未确定。三、临床症状病鱼停止游泳,鱼眼凹陷,皮肤上出现苍白的块斑与水泡,     

锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立

本文根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(Single cross priming amplification,SCPA)进行扩增及优化反应体系,并结合核酸试纸条技术(Nucleic acid test strip detection method),建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法(KHV-SCPA)。KHV-SCPA法可在63℃下60min内实现循环扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较之常规PCR方法提高约1000倍。结合核酸试纸条检测技术,在3~5min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。     

锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白基因的PCR扩增与序列分析

为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白（KHV-MEP）的功能及锦鲤疱疹病毒（KHV）的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤（Cyprinus carpio Koi）肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段。将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件TMpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2。所获得的基因片段大小为771bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因（AB178537）的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点（PI）为8.65。该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇。结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因。     

应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒

为建立并优化锦鲤疱疹病毒检测方法,针对目前国内集约化养殖鲤鱼大面积流行的病死现象进行有针对性的检测,对在疫区采集到的病鱼肾脏、肝胰脏、肠等组织,提取基因组DNA,应用锦鲤疱疹病毒特异性引物进行PCR反应,同时设立阴性对照(TE buffer)。通过1%琼脂糖凝胶进行鉴定,与阴性对照比较,在484bp处出现特异性目的条带。经序列测定,所得PCR产物的基因序列与NCBI上锦鲤疱疹病毒的同源率达到99%以上。对同一批次的样品进行重复检测,结果表明该方法具有较好的可重复性,可据此判定结果。通过对锦鲤疱疹病毒的检测,确定了疫区引起框镜鲤(Cyprinus carpio)和建鲤(Cyprinus carpio var Jian)大批死亡的病原为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV),从而对疫区控制、防治方案的制定提供了理论依据。建议尽快在鲤鱼主要养殖区开展KHV流行病学、诊断与检测及免疫预防等方面的研究。     

锦鲤疱疹病毒流行病学及诊断防治技术研究进展

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)引起的一种传染性疾病,主要是引起各生长阶段鲤鱼、框镜鲤、锦鲤等鳃坏死及间质性肾炎,死亡率高达60%～100%,疫情难以控制,已引起各国的高度关注。1998年锦鲤疱疹病毒病首次在以色列暴发,并迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ) ORF81蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF81基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒.应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF81基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树.结果显示,获得了长771 bp的ORF81基因,编码256个氨基酸;预测ORF81基因的理论分子量为28 246.50 u,等电点为8.404;疏水性大于亲水性;信号肽切割部位最可能位于29位的S(丝氨酸);有4个跨膜区;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,不存在N-糖基化位点、存在6个O-糖基化位点和11个磷酸化位点;系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒以色列株属同一分支.     

鲫疱疹病毒ORF31R(CaHV-31R)的特征及其编码蛋白与细胞器共定位

鲫疱疹病毒(Carassius auratus herpesvirus, CaHV)是一种引起鲫急性鳃出血症和高死亡率的病毒病原。病毒要借助功能基因与细胞组分(如细胞器)的相互作用才能完成感染与复制。本实验通过生物信息分析、PCR扩增、重组质粒构建及其与细胞器标记质粒共转染鱼细胞(epithelioma papulosum Cyprinid, EPC)的荧光观察,对预测鲫疱疹病毒基因CaHV-31R编码蛋白的特性、亚细胞定位及与细胞器共定位进行研究。结果显示,鲫疱疹病毒编码蛋白CaHV-31R由313个氨基酸组成,含一个跨膜结构域(248～270 aa)和一个RNase E/G家族蛋白的典型结构域(40～182 aa);与5种来源鲤疱疹病毒同源蛋白多重比对发现,与鲤疱疹病毒II型中的日本株ST-J1和中国株SY-C1的同一性较高(分别为100%和80.7%),与鲤疱疹病毒I型代表株CyHV-1的同一性居中(为26.5%),而与鲤疱疹病毒III型中的德国株CyHV-3(或称锦鲤疱疹病毒Koi herpesvirus,KHV)和中国株CyHV-3-GZ11的同一性最低(分别为20.7%和18.2%);经基因扩增和构建真核重组质粒pEGFP-31R,当用其单独转染EPC细胞,绿色荧光信号主要在细胞质中呈弥散分布,少量在细胞质中或在细胞核外围呈点状分布;当用pEGFP-31R与内质网标记质粒pDsRed2-ER或与高尔基体标记质粒pDsRed2-Golgi共转染细胞,绿色荧光信号在胞质中的分布情况与单独转染时不同,分别能与2种有单层膜结构的细胞器—内质网和高尔基体共定位。研究表明,CaHV-31R是鲫疱疹病毒中一个能编码与细胞器共定位蛋白的基因。     

锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF59的克隆、分析及其主要B细胞表位区的原核表达

从感染锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）的锦鲤（Cyprinus carpiokoi）肾脏组织中提取DNA,通过PCR扩增了KHVORF59基因。该基因全长411bp,所编码的蛋白包含136个氨基酸,分子量14.3kDa,等电点（PI）6.91,有12个潜在的O糖基化位点。此研究克隆的KHVORF59基因第130位碱基由G突变为A,使其编码的第44位氨基酸由Ala突变为Thr。采用DNAStar程序,在综合分析二级结构柔性区、蛋白的亲水性、表面可能性和抗原性指数的基础上,预测了KHVORF59蛋白主要B细胞表位,并将其区段的编码序列与KHVORF59完整编码序列分别克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET32a-ORF59S和pET32a-ORF59C,转入大肠杆菌Rosetta菌株,IPTG诱导表达。SDS-PAGE及WesternBlot分析显示,pET32a-ORF59S可以高效表达,表达的截短KHVORF59蛋白主要以可溶性形式存在,采用HisBindResin填料,层析纯化了该截短蛋白。     

鲢腐败希瓦氏菌株的16S rRNA鉴定

从患病鲢(Hypophthalmichthys molitrix)体表分离获得1株革兰氏阴性细菌,菌株编号为BD1-5,通过细菌形态学观察、革兰氏染色镜检、16S r RNA序列分析以及构建系统发育树分析等进行鉴定研究。结果表明,患病白鲢体表皮肤溃烂,尤其尾部溃烂严重;对该病例主要组织进行镜检未见明显寄生虫;分子生物学检测结果显示鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus, SVCV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ, Cy HV-Ⅱ)和锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)均为阴性;采用PCR方法获得该分离菌株16S r RNA序列片段大小为1 416 bp,与Shewanella putrefaciens(Gen Bank NO.:KX185698)序列相似性为99.72%;构建系统发育树分析显示,该菌株与Shewanella putrefaciens(Gen Bank NO.:KY817253)等自然聚为一枝。综合菌株形态及16S r RNA序列分析,最终推测该分离株为腐败希瓦氏菌(S. putrefaciens),属于革兰氏阴性杆菌。研究结果为证明腐败希瓦氏菌(S. putrefaciens)是鲢养殖过程中一种潜在致病源提供理论依据和参考。     

基于线粒体COI和Cytb基因序列的6种锦鲤(Cyprinus carpio Koi)遗传多样性分析

实验利用线粒体COI基因和Cytb基因的片段序列分析比较了黑锦鲤(Cyprinus carpio Karasugoi Koi)、三色锦鲤(C.carpio Taisho Sanshoku Koi)、红白锦鲤(C.carpio Kohaku Koi)、黄金锦鲤(C.carpio Kigoi Koi)、全白锦鲤(C.carpio Platinum Ogon Koi)和全红锦鲤(C.carpio Higoi Koi)6个锦鲤(Cyprinus carpio Koi)养殖品系的遗传多样性和系统进化关系。结果显示:基因序列分析得到的单倍型数分别为7、6。6个品系均具有较高的单倍型多样性指数和较低的核苷酸多样性指数。群体间遗传分化系数Fst、遗传距离和AMOVA等结果显示品种间变异高于品种内变异,黑锦鲤和黄金锦鲤间、红白锦鲤和三色锦鲤间不存在显著遗传差异,其余品系间差异显著。根据COI和Cytb基因单倍型构建的品系间NJ系统进化树得到相同结果,黑锦鲤和全红锦鲤遗传关系较近,聚为一支。三色锦鲤、红白锦鲤和黄金锦鲤遗传关系较近,聚为一支。全白锦鲤与其他品系的亲缘关系均较远,单独形成一个分支。