茶树CsMAPKK3基因克隆及表达分析

【目的】克隆茶树CsMAPKK3基因,并进行表达分析,为探究CsMAPKK3基因的生物学功能及其抗逆分子机制提供理论支持。【方法】以铁观音为材料,采用RT-PCR克隆其CsMAPKK3基因的全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在不同组织及逆境胁迫下的表达情况。【结果】克隆获得的CsMAPKK3基因（GenBank登录号:AUD40506.1）cDNA序列全长1941 bp,包含完整开放阅读框（ORF）,长度为1557 bp,编码518个氨基酸残基,蛋白相对分子量为57.52 kD,理论等电点（pI）为5.39,为无跨膜螺旋结构和信号肽的不稳定蛋白,含有多个磷酸化位点,定位于细胞质和细胞核中,属于PKc类型的MAPKK,且具有SPS1、S_TKc等催化结构域,以及D（I/L/V）K激活域和S/T-X_3-5-S/T保守域,与中华猕猴桃PSS35243.1亲缘关系最近,且与拟南芥B亚家族聚为一类。CsMAPKK3基因起始密码子上游1714 bp的启动子区序列含有光响应、逆境响应、植物激素和厌氧诱导等相关的顺式作用元件。CsMAPKK3基因在根、茎、叶、花和果中均有表达,其中在茎和果的表达量较高,显著高于在花中的表达量（P<0.05）,但与根和叶中的表达量均无显著差异（P>0.05）。低温胁迫抑制CsMAPKK3基因表达,而脱落酸（ABA）、高盐和干旱胁迫均能诱导CsMAPKK3基因上调表达。【结论】CsMAPKK3基因表达具有组织表达特异性,且参与茶树ABA、高盐、低温和干旱胁迫响应等逆境胁迫的分子调控。     

紫娟茶树bHLH转录因子MYC1基因克隆及表达分析

为探究MYC1基因在紫娟茶树中的生物学功能和表达特性,克隆了MYC1基因,并对该基因序列进行生物学分析,同时采用实时荧光定量PCR对不同光质照射下及不同空间生长的紫娟叶片中MYC1基因进行检测。结果表明,紫娟茶树MYC1基因全长2 576 bp,与葡萄vvMYC1序列具有较高的相似性,都含有一段保守的MYB互作区域;在空间表达中,MYC1表达量大小顺序表现为第二叶>开面叶>芽>成熟叶;在不同光质中,MYC1表达量大小顺序表现为自然光>紫光>绿光>蓝光>黄光。MYC1可能参与了紫娟茶树花青素的生物合成,并且紫娟MYC1基因的表达与光质有关。研究结果可为进一步研究MYC1基因对花青素合成的调控机制提供参考。     

马铃薯StDWF1基因克隆及表达分析

DWF1是油菜素内酯(BR)生物合成途径中的关键基因。为探索StDWF1在马铃薯生长发育中的功能,本实验以马铃薯品种费乌瑞它(Favorita)试管苗为材料,克隆StDWF1基因全长序列,开放阅读框(ORF)为1 704 bp,编码567个氨基酸,蛋白质相对分子质量为66.08 ku,理论等电点为7.96。利用农杆菌介导法在烟草中瞬时表达StDWF1,共聚焦显微镜观察显示StDWF1定位于细胞质。荧光定量分析表明,嫩叶中StDWF1表达量最高,其次是老叶、匍匐茎、主根、茎、块茎。对马铃薯生育期叶片StDWF1表达量进行分析,结果表明在出苗期表达量最高。本实验结果为进一步阐释BR对马铃薯生长发育的调控机制奠定理论基础。     

甜荞FeTCP1基因克隆及胁迫诱导表达分析

以甜荞品种'西农9976'为材料,基于前期干旱转录组学数据挖掘克隆获得FeTCP1,其有1个1 623 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸.蛋白质理化性质预测显示,FeTCP1蛋白质的分子质量为58 623.75 ku,等电点为5.97,疏水性总平均值为-0.032,属于亲水性蛋白.同源性分析显示,FeTCP1与甜菜...     

芜菁BrrLOX7基因克隆、表达及生物信息学分析

脂氧合酶(lipoxygenase, EC 1.13.11.12;简称LOX),是一类由非血红素铁组成的脂肪酸双加氧酶,在植物的生长发育和环境胁迫响应中发挥着重要作用,本研究以4片真叶期芜菁幼苗为材料,利用同源克隆技术从芜菁中克隆BrrLOX7基因。利用生物信息学方法分析BrrLOX7基因序列。使用荧光定量PCR技术分析非生物胁迫下BrrLOX7基因表达模式。结果显示,克隆的BrrLOX7基因CDS长度为2 715 bp,编码904个氨基酸,编码的蛋白质分子量为103.10 ku,无跨膜结构和信号肽。亚细胞定位预测显示,该基因编码的蛋白位于叶绿体中,该蛋白与白菜和萝卜的序列同源性和遗传距离最近。不同胁迫下的表达模式显示,BrrLOX7基因参与对4种胁迫(盐胁迫、冷胁迫、热胁迫、干旱胁迫)的响应。研究结果将为BrrLOX7基因的功能研究奠定基础。     

猕猴桃 AcNPR1基因克隆及抗病响应表达分析

为探究猕猴桃 AcNPR1基因在抗病响应中的作用及其在不同抗性猕猴桃品种间抗性差异机制,以高感病品种‘红阳’和抗病品种‘徐香’猕猴桃叶片为材料克隆 AcNPR1基因序列;利用ExPASy-ProtParam tool、MEGA 7.0 等对‘红阳’AcNPR1蛋白的理化性质进行分析、亚细胞定位进行预测、进化关系等进行分析;通过RT-qPCR分析 AcNPR1基因在不同品种猕猴桃植株中的组织表达模式以及病原菌和水杨酸（Salcylic acid,SA）对其诱导表达模式。结果表明, AcNPR1基因开放阅读框1 770 bp（Genbank 登录号MW881148）,编码589个氨基酸,理论等电点6.27,具有典型的BTB/POZ结构域、ANK重复序列、NPR-like等NPR1蛋白保守结构域,AcNPR1蛋白预测定位于细胞核中;蛋白质的二级结构以α螺旋和无规卷曲为主;系统进化显示其与茶树的亲缘关系最为密切,相似性为83.94%。组织特异性分析表明 AcNPR1基因在‘红阳’和‘徐香’品种叶片中的表达水平最高。在丁香假单胞杆菌猕猴桃致变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）处理下,抗病品种‘徐香’ AcNPR1基因的相对表达水平在处理0 h后迅速增加,为对照的3.6倍;而高感品种‘红阳’在48 h后显著增加,为对照的2.7倍。在SA+Psa处理下,‘徐香’ AcNPR1基因相对表达水平在24 h内达到最高水平,是对照的7.7倍;‘红阳’在72 h后达到最大值,仅为对照的1.6倍。 ‘徐香’ AcNPR1基因的抗病响应反应早于‘红阳’且更易受SA诱导表达。 AcNPR1基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,在不同抗性的猕猴桃品种抗病机制中存在差异。     

菜心 BcCIPK23 基因克隆及表达特性分析

【目的】CIPK23 基 因 在 植 物 生 长 发 育 和 矿 质 营 养 吸 收 中 具 有 重 要 作 用, 但 在 菜 心 中 关 于BcCIPK23 基因及其功能的研究尚无报道,该研究可为探讨 BcCIPK23 在菜心植株生长发育和氮代谢中的生物学功能提供理论参考。【方法】以‘油绿 501’菜心为材料,采用同源克隆法克隆到菜心 BcCIPK23 全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析,探究其组织表达特性和对不同氮源的响应。【结果】菜心 BcCIPK23 基因 CDS 全长为 1 450 bp,编码 482 个氨基酸,分子量是 53.41 kD,理论等电点为 9.28,具有 CIPK 家族成员的STKc-SnRK3 和 CIPK-C 保守结构域。系统进化树分析表明,菜心 BcCIPK23 和白菜 BrCIPK23 进化关系最近。BcCIPK23 在菜心叶片、叶柄、薹茎、根系、花等组织中均有表达,但主要集中在叶片、叶柄、薹茎中表达;BcCIPK23 表达也受氮源及其水平的影响,无论供 NO3- 还是供 NH4+,其表达水平均随氮浓度增加而降低。推测该基因在叶片、薹茎发育和氮素吸收利用中发挥关键作用。【结论】菜心 BcCIPK23 为 CIPK 基因家族成员,主要在叶片等生长活跃的器官高表达,且可响应氮源及氮浓度变化,参与植物生长发育和氮代谢过程。     

特异性表达基因克隆的策略

将特性表达基因克隆技术按产生的时代与所利用的技术，划分成三个阶段，并对每个阶段有代表性的技术、原理和优缺点进行了介绍，旨在为研究者选择实验方法提供理论依据。     

水牛波形蛋白基因克隆及其表达分析

[目的]克隆水牛波形蛋白(VIM)基因,并明确VIM基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况,为研究VIM在卵母细胞成熟及附植前胚胎发育中的作用机理打下基础.[方法]根据GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列设计引物,采用RT-PCR克隆水牛VIM基因,利用在线软件程序对克隆获得的水牛VIM基因进行生物信息学分析,同时以细胞免疫荧光试验检测VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况.[结果]水牛VIM基因长度为1469 bp,其编码区长度1401 bp,编码466个氨基酸.水牛VIM基因序列与人类、黑猩猩、食蟹猴、家犬、马和牛的VIM基因序列具有高度的同源性,分别为93%、93%、93%、94%、94%和99%;基于VIM基因序列构建的系统发育进化树也显示水牛与牛的亲缘关系最近.水牛VIM的分子量为53.73 kD,理论等电点(pI)5.05,主要在线粒体中表达,稳定性差(不稳定系数53.65),具有较强的亲水性,无跨膜结构,不属于分泌型蛋白,其蛋白结构以α-螺旋为主.VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中均有表达,且在成熟卵母细胞中的表达量明显高于早期胚胎.[结论]水牛VIM基因编码序列具有较高的保守性,且在水牛成熟卵母细胞(MII期)中的表达量明显高于早期胚胎(2-细胞阶段).     

墨兰 CsAP1-A 基因克隆及表达分析

【目的】AP1 基因在植物的花器官发育和开花调控中发挥重要作用,对墨兰 AP1 基因进行克隆与表达分析可为研究其在墨兰花发育和开花调控中的作用提供前期基础。【方法】以墨兰品种‘小香’为材料,克隆到 1 个 AP1 基因,命名为 CsAP1-A。通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系,利用 RT-qPCR 方法分别检测 CsAP1-A 在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况;通过转录组测序分析 CsAP1-A 在 5 个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况;通过蛋白互作预测软件分析 CsAP1-A 与其他蛋白的互作关系。【结果】CsAP1-A 基因编码区为 744 bp,编码 248 个氨基酸,含有高度保守的 MADS-box 和K-box 结构域,符合 MADS-box 转录因子家族特征。CsAP1-A 与其他兰科植物 AP1 蛋白相似性较高,其中与春兰 AP1/FUL3（APY18447.1）和蕙兰 MADS1（AGE15496.1）的同源性最高。RT-qPCR 分析结果表明,CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达,在花中表达量最高,且集中在花芽分化初期（S1）高表达。在不同花型的墨兰品种中,CsAP1-A 在 WT（普通型）、MPV（重瓣花型）、LaPV（花瓣唇瓣化花型）和 NLV（唇瓣萼片化花型）4 种花型的合蕊柱中表达量均最高,而在萼片中表达量最低;在合蕊柱异常发育的 MPV 中,CsAP1-A 在合蕊柱的表达量显著提高,而在花瓣蕊柱化的梅瓣花型（GPV）中整体表达量最高,且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。蛋白互作预测 CsAP1-A 蛋白可与 MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等 10 个蛋白存在互作关系。【结论】墨兰 CsAP1-A 的基因结构、进化关系、时空表达情况和蛋白互作预测可为墨兰花发育的研究提供理论依据,对进一步揭示 CsAP1-A 基因在墨兰成花过程中的作用奠定基础。     

斜带石斑鱼BAG-1基因克隆及表达分析

【目的】明确斜带石斑鱼（Epinephelu coioides）BAG-1基因（EcBAG-1）的结构特征、组织表达分布及在脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（PolyI:C）刺激后的表达变化,进一步揭示鱼类BAG-1在病原感染中的作用机制,也为了解鱼类的抗病免疫提供参考依据。【方法】依据EcBAG-1基因EST序列设计特异...     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

玉米抗病相关基因NPR1的同源克隆及表达分析

NPR1是植物系统获得性(systemic acquired resistance,SAR)抗病反应中的关键基因,对植物的广谱抗性起重要调控作用。以玉米自交系"齐319"为材料,通过PCR方法克隆到一个玉米NPR1基因(命名为Zm NPR1)。序列分析结果显示Zm NPR1包含两个保守结构域POZ/BTB位点和Ankyrin repeat锚蛋白重复位点。蛋白质聚类分析表明Zm NPR1与水稻Os NPR2的同源性最高。亚细胞定位结果显示Zm NPR1定位于洋葱表皮细胞的细胞核中。半定量PCR结果显示,Zm NPR1和玉米防卫基因PAL(编码苯丙氨酸解氨酶)响应水杨酸、玉米矮花叶病毒和玉米小斑病原菌的诱导并显著上调表达;而Zm NPR1和PAL的表达水平受到茉莉酸甲酯的明显抑制。这表明Zm NPR1在玉米中参与到水杨酸介导的抗病反应通路。     

青杄类伸展蛋白基因PwELP1的克隆及表达分析

【目的】克隆青杄类伸展蛋白(extensin-like proteins,ELPs)基因PwELP1并分析该基因的表达特性,为研究ELP基因家族的功能奠定基础。【方法】以青杄cDNA文库为模板,用RACE-PCR方法克隆青杄类伸展蛋白编码基因PwELP1的cDNA全长,利用DNAMAN确定PwELP1的编码框及蛋白氨基酸的翻译,运用clustalx软件与Espript工具进行多序列比对,利用MEGA 5软件的邻位相连法构建系统树,并对编码蛋白进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测PwELP1基因在青杄不同组织中表达的特异性、花粉和种子不同萌发时期及幼苗受到不同逆境处理时的表达差异,分析该基因的组织发育及逆境响应表达特点。【结果】PwELP1基因全长832bp,其编码一个由159个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的N端与C端均有比较保守的结构域;此蛋白二级结构由1个α-螺旋、5个β-折叠与3个β-转角结构构成,对其三级结构的预测印证了这一结果,同时发现该蛋白中还存在部分无规则卷曲。其分子质量为17.03ku,理论等电点为5.81。PwELP1在青杄花粉中的表达量较高,且在花粉萌发后期(30~36h)以及种子萌发初期(第2天)表达量高;PwELP1的表达不同程度地受低温、高温、茉莉酸甲酯(MeJA)、H_2O_2、脱水以及脱落酸(ABA)等非生物逆境胁迫处理的诱导,尤其是H_2O_2、高温和ABA,处理初期表达量就显著升高。【结论】PwELP1在青杄花粉和种子萌发过程中可能发挥重要功能,并可参与青杄对非生物逆境胁迫的响应过程。     

高羊茅FaFKF1基因克隆、亚细胞定位及节律表达分析

【目的】克隆高羊茅蓝光受体家族基因（FaFKF1）,分析其序列特征及亚细胞定位,并检测其在不同光照处理下的节律表达特征,为探索其在成花中的调控机制及高羊茅光周期适应性育种提供理论依据。【方法】采用RACE方法克隆FaFKF1基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测FaFKF1基因不同光照处理和不同生长阶段的节律表达特征。【结果】克隆获得FaFKF1基因cDNA全长为2266 bp,开放阅读框（ORF）为1881 bp,编码626个氨基酸残基,蛋白分子量为68.89 kD,理论等电点（pI）为5.76,脂肪系数为80.99,不稳定指数为39.81,属于较稳定的亲水性蛋白,亚细胞定位于细胞核。FaFKF1蛋白的二级结构包含α-螺旋（24.92%）,无规则卷曲（44.89%）、延伸链（23.16%）和β-转角（7.03%）。FaFKF1蛋白与大豆（NP_001235886.2）、大麦（KAE8795993.1）和二穗短柄草（XP_003577479.1）的氨基酸序列相似性较高,为79.50%~87.68%,且与二穗短柄草FKF1蛋白的亲缘关系最近,其次是大麦和小麦。长日照处理下,FaFKF1基因在苗期、分蘖期、孕穗期和抽穗期的叶片中均有表达,相对表达量变化趋势也较相似,均在ZT8时（即下午16:00）达最高峰,呈现出24 h的昼夜节律,但在孕穗期和抽穗期的相对表达量明显较高。在长日照和短日照基础上施加不同光照处理下,FaFKF1基因均能通过自身调节来适应环境的变化,虽然表达峰出现时间不一致,但整体上能维持24 h的昼夜节律。【结论】FaFKF1基因在细胞核发挥作用,且在不同光照下均呈现节律表达,受光周期的诱导调控。     

三角帆蚌中WNT4基因克隆及表达分析

为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用,通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA,共1560 bp,其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp,开放阅读框（ORF）为1140 bp,可以编码379个氨基酸,且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后,发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达,表明其参与了多样的生物学过程,在腮、斧足、肝中表达量较高,在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异,且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示,WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号,推测WNT4基因与性别决定相关。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

拟南芥AtWRKY33基因启动子的克隆及表达分析

以野生型拟南芥为材料,采用PCR技术克隆得到了拟南芥AtWRKY33基因起始密码子ATG上游1 629 bp启动子序列,并利用该启动子驱动GUS基因在野生型拟南芥中表达,对获得的转基因拟南芥采用重金属Cd处理不同时间,进行GUS染色及定量分析。结果表明：AtWRKY33基因启动子与GUS融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达;拟南芥植株中的AtWRKY33基因在根中大量表达;定性与定量实验均显示经重金属Cd处理后的拟南芥幼苗中AtWRKY33基因随着时间增加而被显著诱导表达。说明该基因响应重金属Cd胁迫。     

淡水养殖凡纳滨对虾生长相关基因HDAC1克隆及其表达分析

【目的】分析组蛋白去乙酰基酶1基因（HDAC1）在不同淡水生长特性家系凡纳滨对虾中的表达情况,明确HDAC1基因在对虾淡水养殖过程中的功能作用,为揭示凡纳滨对虾生长调控的分子机制提供参考依据。【方法】通过RACE克隆凡纳滨对虾HADC1基因cDNA序列,利用DNAMAN、ProtParam、ProtScale、PSOR...