新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF086蛋白的原核表达、纯化及抗体制备

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优化,确定在0.7 mmol/L IPTG、16℃诱导14 h时可溶性SGIV ORF086重组蛋白占重组蛋白的60%。经镍琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白,纯化度达95%以上。用纯化的SGIV ORF086蛋白免疫小鼠,获得了高效特异的SGIV ORF086抗血清。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF086蛋白的原核表达、纯化及抗体制备

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优化,确定在0.7 mmol/L IPTG、16℃诱导14 h时可溶性SGIV ORF086重组蛋白占重组蛋白的60%。经镍琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白,纯化度达95%以上。用纯化的SGIV ORF086蛋白免疫小鼠,获得了高效特异的SGIV ORF086抗血清。     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

桑叶水提物及异槲皮苷成分抗石斑鱼虹彩病毒作用机制研究

【目的】探究桑叶提取物成分对石斑鱼虹彩病毒（SGIV）的抑制作用,并对其抗病毒机制进行研究,为利用桑叶提取物成分研发抗SGIV药物提供理论依据,也为开发高效安全的新型抗病毒渔用药物提供新思路。【方法】利用石斑鱼脾脏组织细胞系（GS）,通过光学显微镜观察及CCK-8检测分析桑叶水提物（Morus alba L.water extracts,MAE）及其活性成分异槲皮苷（Isoquercetin,IQ）的安全工作浓度,然后使用实时荧光定量PCR及核酸适配体荧光分子探针技术（Q2-AFMP）分析MAE和IQ对SGIV的抗病毒效果;通过分析SGIV感染GS细胞中MCP基因和VP19基因的表达水平,分析IQ对SGIV的粒子结构及其与宿主细胞表面结合、侵入宿主细胞和在宿主细胞中复制的影响,探究IQ体外抗SGIV的作用机制。【结果】桑叶源化合物成分（MAE和IQ）对GS细胞的最高安全工作浓度为:MAE≤10.0 mg/mL,IQ≤1000.0μg/mL。与接入SGIV的GS细胞相比,在以安全工作浓度的MAE （10.0 mg/mL）和IQ （1000.0μg/mL）分别接入SGIV孵育感染的GS细胞后细胞病变（CPEs）明显减少,MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势（P<0.01,下同）,GS细胞荧光值也极显著降低,表明桑叶源化合物成分能有效抑制SGIV感染。以IQ处理SGIV孵育感染的GS细胞,其细胞内MCP基因和VP19基因的相对表达量均呈极显著下降趋势,提示IQ能破坏SGIV的粒子结构,并干扰SGIV对宿主细胞的吸附、侵入和复制。【结论】MAE和IQ对SGIV具有良好的抗病毒效果,其中IQ能在病毒吸附、侵入和复制阶段发挥抗病毒作用,即桑叶源化合物成分在防治SGIV感染方面具有潜在的应用价值,可作为研发抗SGIV感染的有效药用成分。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达

[目的]为VP1蛋白的免疫学研究和鸡贫血病毒基因工程疫苗的研制奠定基础。[方法]将1个新克隆的鸡贫血病毒vpl基因（AF448446）在大肠杆菌DE3中进行表达,并对该蛋白进行纯化。[结果]结果表明：已成功构建了表达载体pET30（b^＋）-vp1;VP1蛋白已成功诱导表达并得以纯化;获得的VP1蛋白序列与已发表的VPl蛋白序列存在差异。[结论]试验克隆的vp1基因大小为1347bp,编码449个氨基酸的蛋白。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

八角茴香水提物调控宿主免疫反应抗石斑鱼虹彩病毒的机制研究

【目的】从免疫应答角度探析八角茴香（Illicium verum Hook.f.）水提物（IVE）调控宿主免疫反应而发挥抗石斑鱼虹彩病毒（SGIV）的作用机制,为八角茴香应用于石斑鱼健康养殖产业及开发绿色、健康、高效渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察及CCK-8细胞活力测定确定IVE的细胞安全工作浓度,利用实时荧光定量PCR检测IVE对宿主细胞干扰素相关基因（IFN、STAT1、PKR、ISG15、KK_α、STING和IRF3）表达的影响,并以光学显微镜观察和实时荧光定量PCR分析IVE在细胞水平抗SGIV的效果,通过石斑鱼活体试验进一步验证IVE的抗SGIV效果。【结果】IVE细胞水平的安全工作浓度≤0.50 mg/mL; IVE预处理GS细胞2 h可显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01,下同）激活干扰素相关基因（IFN、STAT1、PKR、IKK_α、IRF3和STING）的表达。SGIV感染GS细胞24和48 h时,经IVE预处理的细胞病变效应（CPEs）明显少于未使用IVE预处理的GS细胞,且细胞内SGIV的MCP基因相对表达量极显著降低,表明IVE可有效抑制SGIV感染;此外,IVE可增强SGIV感染GS细胞中干扰素相关基因的表达,具体表现为IFN、STAT1和IRF3基因在病毒感染后24 h极显著上调,PKR、IKK_α、ISG15和STING基因在病毒感染后24和48 h呈显著或极显著上调趋势。在石斑鱼活体试验中,IVE与SGIV混合腹腔注射后石斑鱼脾脏中SGIV的MCP基因相对表达量在病毒感染后24和48 h均极显著低于仅注射SGIV的石斑鱼。【结论】IVE具有抑制SGIV感染的功能,其作用机制可能是通过诱导干扰素相关基因表达而激活宿主的抗病毒状态,从而发挥间接抗SGIV效果;也说明八角茴香在水产疫病防控中具有研发成渔用抗病功能制剂的潜力。     

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)核衣壳蛋白的克隆、表达与免疫印迹

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N蛋白)基因克隆到原核表达载体pET-28α( )中,得到重组质粒pET-PRRSV/N,并转化入受体菌BL21中.转化子经IPTG诱导表达4 h后,表达蛋白量达到高峰.经15%SDS-PAGE电泳检测和经Western blotting分析,表达蛋白大小约为17 kD,符合预期结果,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,而不与阴性血清反应.这说明表达蛋白具有高度免疫反应特异性.     

赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化

[目的]优化赤点石斑鱼神经坏死病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因的原核表达条件。[方法]采用RT-PCR技术扩增出赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因,构建重组表达载体pRSETA-MCP,以其转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS,在不同培养基、温度、pH值条件下进行诱导表达。[结果]重组菌在SOB和LB培养基、pH值7.0、37℃条件下表达量最高,所得的融合蛋白分子量约为44.5 kD。[结论]该研究为RGNNV-MCP疫苗研制奠定了基础。     

石斑鱼虹彩病毒SGIV感染致病的细胞分子基础及免疫防控对策

虹彩病毒(Iridovirus)是目前海水和淡水养殖鱼类最严重的病毒性病原之一,已从100多种鱼类中分离鉴定出该病毒。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离鉴定的高致病性虹彩病毒,是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒属Iridovirus 1种新的病毒。本文从以下几个方面对SGIV的研究进行综述:SGIV的形态、超微结构及其在石斑鱼细胞中的复制和装配过程;SGIV病毒基因组、转录组、囊膜蛋白质组及miRNAs的解析;SGIV感染宿主靶标组织的鉴定;病毒侵染的入侵方式、运动轨迹和胞内运输的实时追踪;SGIV感染宿主引起类凋亡的死亡机制及介导的信号通路的揭示;多种宿主免疫抗病基因对病毒感染的调节作用;多种SGIV的检测技术,包括基于抗体的流式细胞技术、微流控芯片检测技术、环介导等温扩增技术及核酸适配体检测方法等;SGIV的灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗的研制等。以期为深入阐明SGIV感染致病机理奠定坚实的理论基础,为发展抗病毒对策提供技术支撑。     

中华鳖虹彩病毒的纯化及分析

为制备高纯度的中华鳖虹彩病毒,分析其免疫相关抗原,采用3种方法纯化中华鳖虹彩病毒粒子并对其结构蛋白进行了初步分析.结果表明:差速离心法回收的样品中病毒纯度差、密度低,在电镜下不易观察到病毒粒子;病毒培养物经冻融、磁力搅拌、超声处理后,进行差速离心可提高病毒的回收率,但超声处理易造成病毒结构破坏;病毒培养物经离心浓缩、匀浆、磁力搅拌处理,再通过差速和蔗糖密度梯度二步离心纯化后,在蔗糖密度为30%～40%、40%～50%和50%～60%之间分层的样品中均可观察到病毒粒子,其中,蔗糖密度为50%～60%之间回收的病毒粒子纯度最高,且结构完好.SDSPAGE分析表明,纯化病毒至少含20条蛋白条带,分子量为50kDa的核衣壳蛋白是中华鳖虹彩病毒的高丰度蛋白.Western-blot分析结果证实大多数蛋白条带能被鼠抗中华鳖虹彩病毒高免血清特异性地识别.     

栗疫菌CpIAP基因生物信息学分析及功能研究

寻找栗疫菌的凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)类蛋白,明确该蛋白与其他物种IAPs的进化关系,并对CpIAP基因功能进行初步研究.以IAPs家族的典型结构域“BIR”为靶标,对栗疫菌基因组数据库进行BLAST搜索.运用生物信息学对预测的CpIAP蛋白结构进行分析并构建系统进化树;采用同源重组的策略,构建CpIAP基因缺失突变体,并重新导入该基因全长片段获得互补株.结果从栗疫菌中鉴定了1个IAP基因,Southern blot验证为单拷贝.生物信息学分析表明:CpIAP基因全长2 997 bp,编码920个氨基酸,具有2个BIR结构域;进化关系上CpIAP与人Survivin和酵母IAP较近.CpIAP敲除突变体命名为△IAP,△IAP菌落形态改变,生长速率减慢,致病力下降,丧失产孢能力.上述结果表明:CpIAP参与了栗疫菌的菌落形态建成、分生孢子形成和致病过程.     

猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性分析

【目的】在昆虫细胞表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap),并对表达的重组蛋白~*Cap进行免疫原性分析。【方法】将含有PCV2-ORF2基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-ORF2转染昆虫细胞进行蛋白表达试验,再用纯化的~*Cap和质粒pcDNA3.1-ORF2分别免疫小鼠,比较二者的免疫效果。【结果】由PCV2-ORF2基因编码的Cap结构蛋白在昆虫细胞中正确表达,相对分子质量约为32 000。~*Cap能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。~*Cap免疫组在细胞免疫水平及体液免疫水平的免疫效果均优于pcDNA3.1-ORF2免疫组。【结论】重组蛋白~*Cap可替代全病毒,具有PCV2疫苗潜在的应用价值。研究结果为后续的PCV2病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定试验基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2.将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白.通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其抗原性分析

根据GenBank中登录的PCV-2序列,设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去除核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因,经Bam HI和Xho I双酶切后将其插入到表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,并转化到表达菌株Rossetta(DM3)中,采用IPTG进行诱导表达,采用SDS-PAGE薄层灰度分析表达情况,收集菌体,使用GST-Protein Purification Kit亲和层析纯化方法对表达的GST-Cap融合蛋白蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳检测纯化效果,Western blot分析纯化后的重组Cap蛋白(rCap)免疫学活性。结果表明,成功克隆了大小为579 bp去除核定位信号的ORF2基因,成功诱导表达出预期大小45.3 ku相一致的rCap蛋白,表达量占总菌体的25%,纯化后的rCap蛋白SDS-PAGE电泳分析纯度达到90%以上,Western blot分析表明纯化的rCap蛋白能与PCV-2阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性。     

大鲵虹彩病毒的分离纯化及其MCP基因序列分

【目的】确定陕西省略阳县某大鲵养殖场高致死性疾病的病原,分析其主要衣壳蛋白(MCP)的基因特征。【方法】采集患病大鲵,观察其临床症状,取其脏器组织,处理后分别分离细菌和接种鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞,观察细胞病变,分离病毒;对病原进行增殖,采用蔗糖密度梯度(20%,30%,40%,50%,60%)离心法进行纯化,电镜观察纯化样品。克隆分离病毒的MCP基因,测定其序列并进行系统进化树分析。【结果】患病大鲵背部有溃疡、头部胀大且有出血点,尾部有轻微的溃烂。取病鲵内脏组织样品分离病原,未分离到细菌;处理的内脏组织感染EPC细胞,出现细胞病变。电镜观察证实,在蔗糖密度梯度为50%~60%的样品中,病毒粒子的纯度最高,且结构较为完整;病毒粒子的直径约150nm,与虹彩病毒相似。MCPPCR扩增得到了预期长度(1 392bp)的特异性产物。NCBI BLAST结果显示,扩增的MCP序列与蛙病毒属的感染性造血器官坏死病毒(EHNV)、食用蛙病毒(RSV)、普通产婆蟾病毒(CMTV)以及梭鲈虹彩病毒(PPIV)的MCP全长的同源性最高,达到99%;与中华鳖虹彩病毒(STIV)、蛙病毒3型(FV3)、虎纹蛙虹彩病毒(RTV)等MCP全长的同源性为98%。系统发育分析结果显示,导致该例大鲵发病的病毒为蛙病毒属的虹彩病毒。【结论】造成陕西省略阳县某大鲵养殖场大鲵大量死亡的病原为蛙病毒属的虹彩病毒,将该株病毒命名为大鲵虹彩病毒略阳分离株(CGSIV-LY1112)。